【摘要】：為了探究蝙蝠蛾擬青霉與放線菌共培養(yǎng)對次生代謝產(chǎn)物的影響。從冬蟲夏草周圍微生態(tài)系統(tǒng)中分離獲得一株具有較強(qiáng)抑菌活性的放線菌TY134,通過16S r DNA序列分析,鑒定為極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus)。以大米固體培養(yǎng)基作為發(fā)酵基質(zhì)分別進(jìn)行蝙蝠蛾擬青霉單培養(yǎng)、放線菌TY134單培養(yǎng)以及蝙蝠蛾擬青霉與放線菌TY134共培養(yǎng),培養(yǎng)30 d之后,將發(fā)酵產(chǎn)物用乙酸乙酯超聲輔助提取,采用高效液相色譜(HPLC)和雙層平板打孔法分別分析了單培養(yǎng)和共培養(yǎng)乙酸乙酯提取物化學(xué)成分和抑菌活性的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:共培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物在保留時間Rt=14.143 min處出現(xiàn)了一個新增的吸收峰,而在單培養(yǎng)中并沒有這個吸收峰的出現(xiàn);而且共培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯提取物的抑菌活性明顯要強(qiáng)于單培養(yǎng),產(chǎn)生了新的抑菌活性物質(zhì)。說明共培養(yǎng)可作為一種產(chǎn)生新的生物活性次級代謝產(chǎn)物的有效途徑。
【圖文】：

M:2000bpDNAMarker;1～3均為目的條帶圖1TY134菌株的16SrDNAPCＲ擴(kuò)增電泳圖Fig.1Electrophoresisof16SrDNAPCＲproductofactino-myceteTY134(NＲ042904)和KitasatosporaniigatensisNBＲC16453(AB249960)作為外圍群，選取16株同屬鏈霉菌的16SrDNA的序列作為參考菌株進(jìn)行同源性比對分析，利用MEGA7．0軟件、使用鄰接法(Neighbour-Joining)構(gòu)建TY134菌株與參考菌株16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，TY134菌株與Streptomycesfulvissi-musNBＲC13482(AB184434)、Streptomycestacrolimi-cusATCC55098(FN429653)處于同一分支上(見圖2)。由此可以確認(rèn)TY134菌株為極暗黃鏈霉菌Streptomycesfulvissimus。圖2根據(jù)16SrDNA序列構(gòu)建的菌株TY134系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2PhylogenetictreeofthestrainTY134basedon16SrDNAsequences2．2抑菌試驗(yàn)利用菌餅法測定了放線菌TY134對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用(見表1)。由此得知，放線菌TY134對金黃色葡萄球菌、表1放線菌TY134菌株的抑菌活性Table1Anti-microbialactivityofactinomyceteTY134strain靶標(biāo)菌Targetedpathogens放線菌TY134ActinomyceteTY134空白對照Blankcontrol(CK)金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus+－大腸桿菌Escherichiacoli++－枯草芽胞桿菌Ｒacillussubtilis+－白色念珠菌Candidaalbicans－－注:“++”表示有強(qiáng)烈的抑菌活性(抑菌直徑＞15mm);“+”表示有抑菌活性(0＜抑菌直徑＜15mm);“－”表示無抑菌活性。Note:“++”indicatedstronganti-microbialactivity(Diameter＞15mm);“+”indicatedmoderateanti-microbialactivity(Diameter＜15mm);“-”in-dicatednoanti-microbialactivity．1088天然產(chǎn)物研究與開發(fā)Vol.29

M:2000bpDNAMarker;1～3均為目的條帶圖1TY134菌株的16SrDNAPCＲ擴(kuò)增電泳圖Fig.1Electrophoresisof16SrDNAPCＲproductofactino-myceteTY134(NＲ042904)和KitasatosporaniigatensisNBＲC16453(AB249960)作為外圍群，選取16株同屬鏈霉菌的16SrDNA的序列作為參考菌株進(jìn)行同源性比對分析，利用MEGA7．0軟件、使用鄰接法(Neighbour-Joining)構(gòu)建TY134菌株與參考菌株16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，TY134菌株與Streptomycesfulvissi-musNBＲC13482(AB184434)、Streptomycestacrolimi-cusATCC55098(FN429653)處于同一分支上(見圖2)。由此可以確認(rèn)TY134菌株為極暗黃鏈霉菌Streptomycesfulvissimus。圖2根據(jù)16SrDNA序列構(gòu)建的菌株TY134系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2PhylogenetictreeofthestrainTY134basedon16SrDNAsequences2．2抑菌試驗(yàn)利用菌餅法測定了放線菌TY134對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用(見表1)。由此得知，放線菌TY134對金黃色葡萄球菌、表1放線菌TY134菌株的抑菌活性Table1Anti-microbialactivityofactinomyceteTY134strain靶標(biāo)菌Targetedpathogens放線菌TY134ActinomyceteTY134空白對照Blankcontrol(CK)金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus+－大腸桿菌Escherichiacoli++－枯草芽胞桿菌Ｒacillussubtilis+－白色念珠菌Candidaalbicans－－注:“++”表示有強(qiáng)烈的抑菌活性(抑菌直徑＞15mm);“+”表示有抑菌活性(0＜抑菌直徑＜15mm);“－”表示無抑菌活性。Note:“++”indicatedstronganti-microbialactivity(Diameter＞15mm);“+”indicatedmoderateanti-microbialactivity(Diameter＜15mm);“-”in-dicatednoanti-microbialactivity．1088天然產(chǎn)物研究與開發(fā)Vol.29

大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，而對白色念珠菌沒有抑菌作用，說明該放線菌TY134菌株能夠產(chǎn)生具有抑菌作用的代謝產(chǎn)物。2．3單培養(yǎng)與共培養(yǎng)發(fā)酵乙酸乙酯提取物的HPLC圖譜分析以大米固體培養(yǎng)基作為發(fā)酵基質(zhì)，將放線菌TY134和蝙蝠蛾擬青霉分別進(jìn)行單培養(yǎng)和共培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯超聲提取，提取物經(jīng)HPLC分析后結(jié)果見圖3，其中A、B和C分別表示蝙蝠蛾擬青霉單培養(yǎng)發(fā)酵、二者共培養(yǎng)發(fā)酵、放線菌TY134單培養(yǎng)發(fā)酵乙酸乙酯提取物的HPLC分析圖譜。從圖3B明顯可以看出，放線菌TY134與蝙蝠蛾擬青霉共培養(yǎng)圖譜中，在保留時間Ｒt=14．143min處出現(xiàn)了一個新增的吸收峰，而在放線菌TY134(C)和蝙蝠蛾擬青霉(A)的單培養(yǎng)圖譜中并沒有這個吸收峰的出現(xiàn)。說明放線菌TY134與蝙蝠蛾擬青霉在共培養(yǎng)發(fā)酵過程中的相互作用使它們產(chǎn)生了新的次級代謝產(chǎn)物，起到了正調(diào)控的作用，因此，可以進(jìn)一步推測共培養(yǎng)發(fā)酵可能會使某些沉默的生物合成基因簇得以激活。這一結(jié)論為今后微生物次生代謝產(chǎn)物的開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。圖3蝙蝠蛾擬青霉單培養(yǎng)(A)、二者共培養(yǎng)發(fā)酵(B)及放線菌TY134菌株單培養(yǎng)(C)發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC色譜圖Fig.3HPLCchromatogramsoffermentationextractsofmonocultureofP．hepiali(A)，actinomyceteTY134(C)andtheirco-cul-ture(B)2．4重現(xiàn)性試驗(yàn)精密稱取相同質(zhì)量的放線菌TY134菌株與蝙蝠蛾擬青霉單培養(yǎng)和共培養(yǎng)的發(fā)酵產(chǎn)物，按照1．2．6項(xiàng)中步驟制備供試品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣測定。以保留時間Ｒt=14．143min處出現(xiàn)的新增吸收峰的峰面積值作為參考，計算該吸收峰含量測定的ＲSD值。試驗(yàn)結(jié)果表明:該吸收峰的ＲSD值為1．15%(＜3%)，表明重現(xiàn)性良好。2．5發(fā)酵產(chǎn)物提取物抑菌試驗(yàn)采用雙層平板打孔法測定了蝙蝠蛾

本文編號：2798488