發(fā)布時(shí)間：2020-08-17 14:15

【摘要】：目的:CPT-11(伊立替康)是治療腸癌的一線化療藥物。腹腔巨噬細(xì)胞與B1細(xì)胞是腹腔內(nèi)最重要的兩類組織定居的固有免疫細(xì)胞,兩者之間相互關(guān)聯(lián),共同維護(hù)胃腸固有免疫穩(wěn)態(tài)。此前的研究發(fā)現(xiàn),CPT-11對(duì)腸上皮和腹腔巨噬細(xì)胞有毒害作用。經(jīng)CPT-11化療后,藥物對(duì)腹腔固有免疫細(xì)胞的損傷,以及損傷后后是否可以自我修復(fù)尚不清楚。為此,在本課題中我們進(jìn)行了四方面的研究:其一,檢測(cè)腹腔注射CPT-11對(duì)腹腔固有免疫細(xì)胞(包括腹腔巨噬細(xì)胞和B1細(xì)胞)表型和數(shù)量的影響;其二,同品系小鼠腹腔細(xì)胞和骨髓細(xì)胞過繼到CPT-11腹腔給藥處理后的小鼠后,檢測(cè)后者腹腔巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的表型和數(shù)量;其三,CPT-11灌胃處理,對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)量的影響;其四,檢測(cè)CPT-11腹腔給藥處理對(duì)抵抗大腸桿菌Escherichia coli感染的免疫能力(生存率)的影響。旨在進(jìn)一步明確CPT-11對(duì)固有免疫細(xì)胞的毒性作用,為有效減輕化療藥物的毒副作用、優(yōu)化化療方案提供實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)。方法:1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):C57BL/6(6-8周齡)小鼠適應(yīng)性養(yǎng)殖一周后,將小鼠分為3組,分別為Control組、Vehicle組和CPT-11組,其中CPT-11組腹腔注射CPT-11(200 mg/kg),Vehicle組注射等量溶劑,Control組不做處理。每組按藥物處理時(shí)間分亞組,各亞組分別為6只小鼠。CPT-11處理當(dāng)天記為day0。繼續(xù)養(yǎng)殖,每天監(jiān)測(cè)小鼠體重變化情況,分別在day3,day7,day14,day28,day56,分別取其腹腔細(xì)胞,經(jīng)抗體標(biāo)記后,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其數(shù)量和表型。其中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)識(shí)分子為CD11b、F4/80和MHCⅡ,B細(xì)胞的表面標(biāo)識(shí)分子為CD23和CD19。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):取小鼠腹腔細(xì)胞,種在玻璃底的dish(5×10~5 cell/dish)中,在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)至貼壁,吸棄未貼壁細(xì)胞,利用免疫熒光顯微技術(shù)檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)識(shí)分子CD11b,F4/80和胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子GATA6的表達(dá)情況。3.細(xì)胞過繼移植:取同品系正常的小鼠腹腔細(xì)胞和骨髓細(xì)胞,分別過繼到經(jīng)腹腔注射CPT-11處理7天后的小鼠體內(nèi)。過繼后三周檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的數(shù)量和比例。4.細(xì)菌感染小鼠實(shí)驗(yàn):小鼠分成3組,分別為Control組、Vehicle組和CPT-11組。Control組不進(jìn)行任何處理,Vehicle組腹腔注射溶劑,CPT-11組腹腔注射200 mg/kg的CPT-11懸濁液。7 d后,把亞致死劑量(1×10~9 CFU)大腸桿菌活菌懸液。每隔6 h觀察一次并且記錄小鼠的生存情況,連續(xù)觀察4天(總共觀察96 h)。5.組織化學(xué)觀察:將小鼠處死后,取出大小腸立即用4%的中性福爾馬林溶液固定,石蠟包埋切片后,用蘇木精-伊紅染色,用蔡司倒置顯微鏡,選擇Zeiss Axio Observer D鏡頭彩色CCD拍照獲取圖片。結(jié)果:1.小鼠腹腔注射CPT-11后,其腹腔巨噬細(xì)胞表型為CD11b~+F4/80~(hi)GATA6~+的大腹腔巨噬細(xì)胞(LPMs)在一周內(nèi)大量消失,但是14天后具有上述表型的細(xì)胞開始逐漸增加,說明該亞群細(xì)胞在自我恢復(fù)之中。然而,LPMs數(shù)量恢復(fù)的速度緩慢,停藥后兩個(gè)月(day56)LPMs的數(shù)量?jī)H及Control或Vehicle對(duì)照小鼠LPMs數(shù)量的一半,說明CPT-11腹腔注射對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞有明顯毒性作用,并且恢復(fù)過程漫長(zhǎng)。2.CPT-11腹腔給藥后,腹腔內(nèi)B1和B2細(xì)胞的數(shù)量明顯下調(diào)。CPT-11處理3天后,小鼠體內(nèi)B細(xì)胞比例占腹腔細(xì)胞總數(shù)的比例下降至3%。但是56天后小鼠腹腔細(xì)胞中B細(xì)胞在數(shù)量上幾乎完全恢復(fù)正常。3.CPT-11腹腔注射處理一周后的小鼠進(jìn)行同品系小鼠腹腔細(xì)胞和骨髓細(xì)胞過繼移植。在上述細(xì)胞移植后21天,分析小鼠體內(nèi)腹腔細(xì)胞的表型和細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示,LPMs(CD11b~+F4/80~hii MHCⅡ~(low))的比例和數(shù)量與對(duì)照組(只經(jīng)CPT-11處理的小鼠)相比都有明顯增加;而CPT-11處理后移植骨髓細(xì)胞的小鼠,其LPMs與對(duì)照組相比在數(shù)量上雖然也有所增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。值得一提的是,上述兩種細(xì)胞過繼移植小鼠中,其SPMs(CD11b~+F4/80~lowow MHCⅡ~(hi))的比例和數(shù)量與對(duì)照組相比均無明顯差異。4.隨后我們觀察了CPT-11腹腔給藥處理是否削弱小鼠抗細(xì)菌(大腸桿菌)感染的能力。CPT-11腹腔注射的小鼠,7天后腹腔注射大腸桿菌,與細(xì)菌感染對(duì)照組和空白對(duì)照組相比其存活率明顯下降。5.CPT-11灌胃對(duì)小鼠腹腔細(xì)胞同樣有損傷作用。小鼠經(jīng)400 mg/kg CPT-11連續(xù)灌胃兩次后,在day3檢測(cè)到腹腔巨噬細(xì)胞(LPMs和SPMs)和B細(xì)胞的比例雖然沒有明顯減少,GATA6陽(yáng)性細(xì)胞的比例也沒有明顯變化,但是腹腔細(xì)胞的總數(shù)與正常對(duì)照小鼠腹腔細(xì)胞總數(shù)相比減少了約三分之一。除此之外,小鼠經(jīng)灌胃處理后從第四天開始陸續(xù)死亡,死亡前(day3)的解剖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),其腸道上皮出現(xiàn)嚴(yán)重的水泡樣病變。另一組實(shí)驗(yàn)采用400 mg/kg CPT-11灌胃一次后,與對(duì)照組小鼠相比,CPT-11處理的小鼠腹腔細(xì)胞總數(shù)在day7和day14也減少到~9×10~5(與Control組相比減少了大約三分之一)。以上結(jié)果說明口服CPT-11對(duì)腹腔固有免疫細(xì)胞的損傷作用(與腹腔注射相比)稍弱,但對(duì)腸道上皮的直接損傷作用很大。結(jié)論:CPT-11對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞有長(zhǎng)期毒性,并且受損的腹腔巨噬細(xì)胞和B1細(xì)胞(屬于固有免疫細(xì)胞)恢復(fù)過程較慢。過繼移植同品系小鼠腹腔細(xì)胞可以加快腹腔固有免疫細(xì)胞的恢復(fù),因此有望借此方法加速化療病人腹腔固有免疫穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)過程。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R965
【圖文】：

圖 1.1 CPT-11 與 SN-38 異構(gòu)體的 pH 依賴性平衡。Figure 1.1 The pH dependence of CPT-11 and SN-38 isomers is balanced. Underphysiological pH, the lactone rings of CPT-11 and SN-38 can be hydrolyzed intocarboxylic isomers. The acidic environment, mainly in the form of lactone, is theactive form of the drug.1.2 CPT-11 代謝過程CPT-11 被兩種羧基酯酶同工酶（CES1 和 CES2）和丁酰膽堿酯酶在人體內(nèi)水解成活性代謝物 SN-38（如圖 1.2）。CES1 和 CES2 主要分布于肝、結(jié)腸、腎和血細(xì)胞，而丁酰膽堿酯酶主要存在于血漿中[16]。這些酯酶的轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在肝內(nèi)，是一個(gè)相對(duì)緩慢和低效的過程，因?yàn)橹挥?2-5%的 CPT-11 被轉(zhuǎn)化為 SN-38[17,

圖 1.2 CPT-11 的代謝和排泄過程圖[6]。CPT-11 經(jīng)過靜脈注射到血液，部分被血液中的羧基酯酶（CES）和丁酰膽堿酯酶水解成活性代謝物 SN-38，由有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（OATP）1B1 轉(zhuǎn)運(yùn)體將 SN-38 主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟。CPT-11 還被肝內(nèi)細(xì)胞色素 P 450（CYP 450）酶，即 CYP3A4 和 CYP3A5 代謝為非活性代謝物 APC和 NPC，NPC 可以在肝臟中由 CES1 和 CES2 轉(zhuǎn)換為 SN-38�；蛘弑桓闻K中的CES1/2 水解為活性形式 SN-38。SN-38 經(jīng)葡萄糖醛酸氧化后，被尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）滅活至 SN-38G，并排出膽汁中[22]。腸道細(xì)菌產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸酶可將 SN-38G 解離為 SN-38，從而導(dǎo)致 SN-38 的腸肝循環(huán)。Figure 1.2 Irinotecan metabolism and excretion. The prodrug irinotecan is hydrolyzed intothe active metabolite SN-38 by two isoforms of carboxylesterases (CES1 and CES2) andbutyrylcholinesterase in the human body.

圖 3.1 CPT-11（200mg/kg）可以快速清除腹腔常駐巨噬細(xì)胞。C57BL/6 雌性小鼠分成五批（五個(gè)時(shí)間段），每批三組：Control 組不處理，Vehicle 組腹腔注射溶劑，CPT-11 組腹腔注射 CPT-11（CPT-11 用量按照小鼠體重 200 mg/kg 計(jì)算，注射體積 500 μL/18g），CPT-11 注射當(dāng)天記為 day0。在 day3 和 day7 分別處死一批小鼠，取腹腔細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，相應(yīng)抗體染色，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其細(xì)胞表型。（A）采用 FlowJo10.0 對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞分析過程圖展示，在 CD11b 陽(yáng)性細(xì)胞群中圈出 LPMs（F4/80hiMHCIIlow）和 SPMs（F4/80lowMHCIIhi）細(xì)胞群。（B）CPT-11處理 3 天和 7 天后的流式檢測(cè)結(jié)果。（C）是對(duì)（B）的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，n=6，***表示 P < 0.001；ns 表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Figure 3.1 CPT-11 treatment rapidly reduced the numbers of peritonealresident macrophages. C57BL/6 were grouped according to their non-treatment

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本文編號(hào)：2795433