發(fā)布時間：2020-08-13 05:40

【摘要】：陽離子化多糖是目前較為常用的一類非病毒基因載體。盡管這類載體具備很高的核酸負(fù)載能力,能通過與電負(fù)性細(xì)胞膜的靜電作用表現(xiàn)出高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,但是在體內(nèi)轉(zhuǎn)運中容易與血漿蛋白快速結(jié)合,從而被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除。故此,提高體內(nèi)轉(zhuǎn)染率是基于陽離子化多糖基因治療急需解決的難題。本課題組在前期研究中借鑒病毒基因載體的核殼結(jié)構(gòu),在透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)與陽離子化官能團聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)中間引入橋鏈,形成具有“多糖-橋鏈-陽離子官能團”結(jié)構(gòu)的陽離子化多糖。該修飾多糖與核酸相互作用時,陽離子官能團PEI可通過靜電相互作用對DNA進(jìn)行壓縮,在橋鏈的牽引下,多糖骨架空間構(gòu)象發(fā)生改變,包裹在PEI-DNA外側(cè)形成自組裝納米囊泡結(jié)構(gòu)。該納米基因載體不僅能夠顯著提高體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)染效率,而且具有生物相容性好、長循環(huán)和腫瘤靶向性等優(yōu)點。但是,橋鏈的引入如何影響載體的核酸遞送并未進(jìn)行深入研究�；诖�,本課題構(gòu)建具有不同橋鏈長度的陽離子化透明質(zhì)酸,考察其核酸遞送能力的變化,以及在乳腺癌基因治療中的應(yīng)用。主要研究內(nèi)容如下:1.載體的合成與表征。利用酰胺反應(yīng)將PEI接枝到HA上合成HA-PEI;分別以己二胺和1,12-二氨基十二烷為橋鏈,將PEI接枝到HA上分別合成HA-6-PEI,HA-12-PEI。借助于核磁共振氫譜、傅里葉紅外光譜等表征載體的結(jié)構(gòu);借助于納米激光粒度儀,透射電子顯微鏡表征載體的粒徑形態(tài);借助于場發(fā)射掃描電子顯微鏡對載體中陽離子官能團的接枝率進(jìn)行測定。實驗結(jié)果表明成功制備得到HA-PEI,HA-6-PEI,HA-12-PEI。DNA凝膠阻滯實驗表明HA-PEI,HA-6-PEI,HA-12-PEI可以成功負(fù)載DNA�；趧討B(tài)光散射與圓二色譜實驗表明,HA-6-PEI,HA-12-PEI負(fù)載質(zhì)粒DNA后能夠發(fā)生自組裝。2.基于小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的體外水平考察。(1)為了考察HA-PEI,HA-6-PEI,HA-12-PEI體外細(xì)胞水平基因傳遞性能,進(jìn)行了細(xì)胞增殖,細(xì)胞攝取,胞內(nèi)分布,細(xì)胞轉(zhuǎn)染,以及細(xì)胞攝取機制的考察。結(jié)果表明,HA-12-PEI對4T1細(xì)胞的增殖、周期、凋亡沒有明顯影響,HA-PEI,HA-6-PEI對細(xì)胞的周期有不同程度影響,但對增殖、凋亡無顯著影響;細(xì)胞攝入6 h后載體攝取量均在90%以上;載體或載體/核酸復(fù)合物復(fù)合物在細(xì)胞攝取過程中主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑且具有劑量依賴性,而經(jīng)橋鏈修飾后還表現(xiàn)出一定的能量依賴性;HA-PEI,HA-6-PEI,HA-12-PEI分別負(fù)載綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,能觀察到明亮的綠色熒光,這說明三種載體均可以負(fù)載核酸轉(zhuǎn)染至細(xì)胞并能夠成功表達(dá)目的蛋白;(2)三個載體分別負(fù)載靶向程序性細(xì)胞死亡分子配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)RNAi表達(dá)質(zhì)粒(shPD-L1)構(gòu)建得到基因治療納米給藥系統(tǒng)HA-PEI/shPD-L1、HA-6-PEI/shPD-L1和HA-12-PEI/shPD-L1,并在4T1細(xì)胞水平考察納米給藥系統(tǒng)的RNAi效應(yīng)。HA-PEI/shPD-L1、HA-6-PEI/shPD-L1和HA-12-PEI/shPD-L1的PD-L1 mRNA表達(dá)與空白對照組相比具有顯著性差異(P0.01),分別降低至7.53%、11.23%、9.40%。HA-PEI/shPD-L1、HA-6-PEI/shPD-L1和HA-12-PEI/shPD-L1的PD-L1蛋白表達(dá)量與空白對照組相比具有顯著性差異(P0.01),分別降低至9.49%、11.07%、11.73%。說明HA-PEI/shPD-L1,HA-6-PEI/shPD-L1,HA-12-PEI/shPD-L1可以在體外細(xì)胞水平成功誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)。3.荷乳腺癌4T1細(xì)胞的BALB/c小鼠體內(nèi)水平考察。(1)血液水平檢測結(jié)果表明:與HA-PEI組相比,HA-6-PEI組與HA-12-PEI組紅細(xì)胞凝集效應(yīng)均降低,血清穩(wěn)定性提高;(2)原位腫瘤抑制活性實驗顯示:HA-PEI/shPD-L1組,HA-6-PEI/shPD-L1組,HA-12-PEI/shPD-L1組抑瘤率分別為59.72%,66.67%,69.44%。HA-PEI/shPD-L1,HA-6-PEI/shPD-L1和HA-12-PEI/shPD-L1給藥系統(tǒng)的PD-L1 mRNA的抑制率分別為51.21%,57.29%,63.02%,蛋白表達(dá)的抑制率分別為39.20%,50.23%,63.44%。實驗結(jié)果表明,與HA-PEI/shPD-L1相比,HA-12-PEI/shPD-L1能顯著抑制原位腫瘤增殖(P0.01),而HA-6-PEI/shPD-L1抑制原位腫瘤增殖活性介于兩者之間。(3)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移活性顯示:HA-PEI/shPD-L1組,HA-6-PEI/shPD-L1組,HA-12-PEI/shPD-L1組對乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的抑制率分別為76.06%,78.26%,86.95%。與HA-PEI/shPD-L1組相比,HA-12-PEI/shPD-L1納米給藥系統(tǒng)能夠顯著抑制小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移(P0.05),而HA-6-PEI/shPD-L1未有顯著性差異。(4)體內(nèi)安全性評價表明,與HA-PEI/shPD-L1相比,HA-12-PEI/sh PD-L1具有更好的生物相容性,HA-6-PEI/shPD-L1生物相容性介于兩者之間。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R943
【圖文】：

3 實驗方法3.1 HA-n-PEI(n=0, 6, 12)的合成HA-n-PEI(n=0, 6, 12)的制備參考文獻(xiàn)[51]，具體步驟如下：HA-PEI：稱取 0.1501 g HA 溶于 15 mL 甲酰胺中，加入 0.0769 g 1-乙基-(3基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiidrochloride，EDC.HCl）和 0.0461 g N-羥基琥珀酰亞胺（N-HydroxysuccinimiS）活化 8 h，稱取 0.5002 g PEI 溶于 10 mL 甲酰胺，逐滴加入到上述活 溶液中，氮氣保護、避光，室溫攪拌 24 h，將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移至截留分子103Da-1.4×104Da 的透析袋中，去離子水透析 48 h，冷凍干燥，得 HA-P

圖 2.2 HA-n-PEI(n=6, 12)的合成路線示意圖Figure 2.2 Synthesis method of HA-n-PEI(n=6, 12)3.2 FITC 標(biāo)記參考文獻(xiàn)[60]，精密稱取 0.0102 g 異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanTC）溶于 10 mL 二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）中，加入 0.04N'-羰基二咪唑（N,N'-Carbonyldiimidazole，CDI），氮氣保護、避光，室活化 4 h，加入 0.0499 g HA-n-PEI(n=0, 6, 12)，繼續(xù)氮氣保護、避光，室反應(yīng) 24 h，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至截留分子量為 8×103Da-1.4×104D析袋中，去離子水透析 72 h，冷凍干燥，得 HA-n-PEI-FITC(n=0, 6, 12)。3.3 核磁共振氫譜（1H-NMR）稱量 0.0149 g 待測樣品溶于 0.55 mL 氘代水中，轉(zhuǎn)移至核磁管中，在室質(zhì)子核磁共振儀進(jìn)行測定，采集樣品的核磁共振波譜，用 MestReNova 核

圖 2.3 HA-PEI 的核磁共振氫譜Figure 2.31H-NMR spectrum of HA-PEI圖 2.4 HA-6-PEI 的核磁共振氫譜Figure 2.41H-NMR spectrum of HA-6-PEI

【參考文獻(xiàn)】

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1 虎義平;姜啟英;陳丹;趙丹軍;陸曉;余海;王青青;周峻;胡秀榮;湯谷平;;以聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精為骨架偶聯(lián)短肽CY11的轉(zhuǎn)基因載體[J];浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2009年01期

本文編號：2791605