【摘要】：急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI)是一種腎功能在短期內(nèi)急性減退的臨床綜合,盡管AKI治療手段在不斷地改進(jìn),但該疾病的發(fā)病率和死亡率仍然很高,這使得全世界的臨床醫(yī)師越來越多地關(guān)注AKI,旨在尋找更為有效的治療手段用于AKI。近年研究發(fā)現(xiàn)腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是引起AKI的重要原因,因此,從逆轉(zhuǎn)細(xì)胞損傷過程入手,借助納米給藥系統(tǒng)將藥物主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞,更為有效地促使胞內(nèi)藥物通過降低炎癥因子、減輕氧化應(yīng)激損傷和改善細(xì)胞凋亡等途徑入手尋找一種有效治療AKI的手段具有十分重要的研究價(jià)值與臨床意義。本研究以人體內(nèi)源性物質(zhì)唾液酸(Sialic Acid,SA)為靶向基團(tuán),構(gòu)建唾液酸介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng),通過增加藥物在腎臟部位的有效蓄積實(shí)現(xiàn)AKI的安全、高效治療。采用唾液酸、聚乙二醇和地塞米松為原料合成了唾液酸-聚乙二醇-地塞米松(Sialic acid-polyethylene glycol-dexamethasone,SA-PEG-DXM)嫁接物,得到的嫁接物材料在水性介質(zhì)中具有較強(qiáng)的自聚集能力(臨界膠束濃度:63.9 ±4.1μg/mL),形成以地塞米松為疏水性內(nèi)核,唾液酸-聚乙二醇為親水性外殼的空白膠束,粒徑在50nm左右,且分布均勻。嫁接物中地塞米松含量為15.9±2.4%,體外釋放結(jié)果顯示地塞米松體外釋放時(shí)間超過48 h,具有較好的緩釋作用。采用溶劑擴(kuò)散法可進(jìn)一步物理包載地塞米松,得到唾液酸-聚乙二醇-地塞米松(SA-PEG-DXM/DXM)載藥膠束。當(dāng)投藥量為10%時(shí),得到藥物總含量為22.5 ±2.1%的載藥膠束,粒徑均在30 nm左右,呈較規(guī)則的球形。體外釋放研究結(jié)果表明包載于膠束中的地塞米松釋放主要在集中在前24 h,這使得SA-PEG-DXM/DXM載藥膠束成為兼具物理包裹和化學(xué)嫁接雙重釋藥特征的藥物遞送系統(tǒng)。以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為模型細(xì)胞對(duì)嫁接物細(xì)胞毒性進(jìn)行考察,結(jié)果顯示其在1～800 μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞的生長及增殖均無影響,可滿足作為藥物載體生物相容性的要求。采用100 ng/mL脂多糖刺激HUVECs構(gòu)建E-selectin受體高表達(dá)的體外炎癥細(xì)胞模型用于考察SA-PEG-DXM嫁接物膠束的主動(dòng)靶向能力,以聚乙二醇-地塞米松(PEG-DXM)嫁接物膠束為對(duì)照,結(jié)果表明炎癥HUVECs對(duì)唾液酸修飾的嫁接物膠束具有更好的攝取行為,且胞內(nèi)嫁接物膠束分布情況與細(xì)胞表面E-selectin受體表達(dá)量一致;采用游離唾液酸阻斷細(xì)胞表面E-selectin受體后,炎癥細(xì)胞對(duì)SA-PEG-DXM嫁接物膠束的攝取量降低,進(jìn)一步證實(shí)SA-PEG-DXM嫁接物膠束的炎癥血管內(nèi)皮細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)是唾液酸與E-selectin受體相互作用的結(jié)果。采用腎臟注射脂多糖構(gòu)建AKI動(dòng)物模型,尾靜脈給藥考察包載熒光探針的嫁接物膠束在模型動(dòng)物體內(nèi)的分布情況,結(jié)果顯示SA-PEG-DXM嫁接物膠束在AKI小鼠腎臟的分布顯著高于PEG-DXM嫁接物膠束及SA-PEG-DXM嫁接物膠束在正常小鼠腎臟的分布。采用ICR小鼠為模型動(dòng)物,通過腎臟注射脂多糖構(gòu)建AKI動(dòng)物模型,考察游離地塞米松、PEG-DXM/DXM載藥膠束和SA-PEG-DXM/DXM載藥膠束在模型動(dòng)物的體內(nèi)藥效。分別在給藥后第2 d和第7 d對(duì)模型動(dòng)物腎臟指數(shù)、腎功能指標(biāo)、炎癥因子和氧化應(yīng)激水平進(jìn)行考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥后第2d,SA-PEG-DXM/DXM載藥膠束明顯減輕動(dòng)物腎臟水腫、降低血肌酐和尿素氮水平、抑制炎癥因子產(chǎn)生及改善氧化應(yīng)激狀態(tài),并且在第7 d的療效更為顯著。采用HE和PAS染色法對(duì)模型動(dòng)物腎臟組織病理形態(tài)進(jìn)行考察,SA-PEG-DXM/DXM載藥膠束較其他制劑更為有效地改善小鼠腎臟組織腎小管擴(kuò)張、腎間質(zhì)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤等。采用TUNEL法和免疫印跡法對(duì)腎臟組織細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行考察,結(jié)果同樣顯示SA-PEG-DXM/DXM載藥膠束顯著可改善改善腎臟組織細(xì)胞凋亡程度。在唾液酸介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)急性腎損傷靶向治療的基礎(chǔ)上,以對(duì)炎癥微環(huán)境中高濃度的基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)特異性敏感的PVGLIG多肽作為葡聚糖和姜黃素間的鏈段,合成唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黃素(SA-DEX-PVGLIG-CUR)聚合物前藥。采用熒光分光光度法測(cè)得SA-DEX-PVGLIG-CUR聚合物前藥中姜黃素的含量為5.38 ± 0.25%,體外釋放實(shí)驗(yàn)證實(shí)SA-DEX-PVGLIG-CUR聚合物前藥在MMP-2酶的作用下可有效釋放藥物,姜黃素在48 h內(nèi)的累積釋放量達(dá)到84.4 ± 5.1%,而對(duì)MMP-2酶無響應(yīng)性SA-DEX-CUR聚合物前藥在同時(shí)間的累積釋放量僅為63.2 ± 4.8%。在脂多糖預(yù)處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)共培養(yǎng)體系中,SA-DEX-PVGLIG-CUR可主動(dòng)靶向于炎癥HUVECs;AKI模型動(dòng)物體內(nèi)分布結(jié)果顯示,唾液酸介導(dǎo)的聚合物前藥具有良好的腎臟靶向能力:給藥后24 h,SA-DEX-PVGLIG-CUR在腎臟的分布量分別是游離姜黃素和DEX-PVGLIG-CUR的16.2倍和3.1倍,并且在腎臟的維持時(shí)間超過48 h。在炎癥微環(huán)境中MMP-2酶作用下,SA-DEX-PVGLIG-CUR還可響應(yīng)性地釋放出游離姜黃素,增加藥物在HK-2細(xì)胞中的分布。采用激光共聚焦顯微鏡同樣觀察到在給予SA-DEX-PVGLIG-CUR的模型動(dòng)物腎小管中姜黃素的分布量要明顯高于SA-DEX-CUR,從細(xì)胞和動(dòng)物水平證明具有炎癥微環(huán)境響應(yīng)性釋藥特征的SA-DEX-PVGLIG-CUR可增加藥物在腎臟部位其他功能細(xì)胞中的藥物分布。采用ICR小鼠為模型動(dòng)物,通過腎臟注射LPS構(gòu)建AKI動(dòng)物模型,通過尾靜脈注射給藥,考察游離姜黃素、SA-DEX-CUR和SA-DEX-PVGLIG-CUR的體內(nèi)療效。給藥48 h后,各項(xiàng)體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)證明SA-DEX-PVGLIG-CUR對(duì)AKI具有最佳的治療效果,包括腎臟指數(shù)、腎功能指標(biāo)、炎癥因子、氧化應(yīng)激及組織病理學(xué)形態(tài)。綜上所述,本課題所設(shè)計(jì)的唾液酸-聚乙二醇-地塞米松載藥膠束和唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黃素聚合物前藥在急性腎損傷模型小鼠體內(nèi),通過其良好的腎臟分布和釋藥特性,提高藥物的治療效果。有望通過藥物的腎臟靶向蓄積,減少給藥頻率,實(shí)現(xiàn)對(duì)急性腎損傷的安全、有效治療。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R943

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