發(fā)布時間：2020-08-13 05:24

【摘要】：急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI)是一種腎功能在短期內急性減退的臨床綜合,盡管AKI治療手段在不斷地改進,但該疾病的發(fā)病率和死亡率仍然很高,這使得全世界的臨床醫(yī)師越來越多地關注AKI,旨在尋找更為有效的治療手段用于AKI。近年研究發(fā)現(xiàn)腎臟血管內皮細胞損傷是引起AKI的重要原因,因此,從逆轉細胞損傷過程入手,借助納米給藥系統(tǒng)將藥物主動轉運至靶細胞,更為有效地促使胞內藥物通過降低炎癥因子、減輕氧化應激損傷和改善細胞凋亡等途徑入手尋找一種有效治療AKI的手段具有十分重要的研究價值與臨床意義。本研究以人體內源性物質唾液酸(Sialic Acid,SA)為靶向基團,構建唾液酸介導的藥物遞送系統(tǒng),通過增加藥物在腎臟部位的有效蓄積實現(xiàn)AKI的安全、高效治療。采用唾液酸、聚乙二醇和地塞米松為原料合成了唾液酸-聚乙二醇-地塞米松(Sialic acid-polyethylene glycol-dexamethasone,SA-PEG-DXM)嫁接物,得到的嫁接物材料在水性介質中具有較強的自聚集能力(臨界膠束濃度:63.9 ±4.1μg/mL),形成以地塞米松為疏水性內核,唾液酸-聚乙二醇為親水性外殼的空白膠束,粒徑在50nm左右,且分布均勻。嫁接物中地塞米松含量為15.9±2.4%,體外釋放結果顯示地塞米松體外釋放時間超過48 h,具有較好的緩釋作用。采用溶劑擴散法可進一步物理包載地塞米松,得到唾液酸-聚乙二醇-地塞米松(SA-PEG-DXM/DXM)載藥膠束。當投藥量為10%時,得到藥物總含量為22.5 ±2.1%的載藥膠束,粒徑均在30 nm左右,呈較規(guī)則的球形。體外釋放研究結果表明包載于膠束中的地塞米松釋放主要在集中在前24 h,這使得SA-PEG-DXM/DXM載藥膠束成為兼具物理包裹和化學嫁接雙重釋藥特征的藥物遞送系統(tǒng)。以人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)為模型細胞對嫁接物細胞毒性進行考察,結果顯示其在1～800 μg/mL濃度范圍內對細胞的生長及增殖均無影響,可滿足作為藥物載體生物相容性的要求。采用100 ng/mL脂多糖刺激HUVECs構建E-selectin受體高表達的體外炎癥細胞模型用于考察SA-PEG-DXM嫁接物膠束的主動靶向能力,以聚乙二醇-地塞米松(PEG-DXM)嫁接物膠束為對照,結果表明炎癥HUVECs對唾液酸修飾的嫁接物膠束具有更好的攝取行為,且胞內嫁接物膠束分布情況與細胞表面E-selectin受體表達量一致;采用游離唾液酸阻斷細胞表面E-selectin受體后,炎癥細胞對SA-PEG-DXM嫁接物膠束的攝取量降低,進一步證實SA-PEG-DXM嫁接物膠束的炎癥血管內皮細胞主動轉運是唾液酸與E-selectin受體相互作用的結果。采用腎臟注射脂多糖構建AKI動物模型,尾靜脈給藥考察包載熒光探針的嫁接物膠束在模型動物體內的分布情況,結果顯示SA-PEG-DXM嫁接物膠束在AKI小鼠腎臟的分布顯著高于PEG-DXM嫁接物膠束及SA-PEG-DXM嫁接物膠束在正常小鼠腎臟的分布。采用ICR小鼠為模型動物,通過腎臟注射脂多糖構建AKI動物模型,考察游離地塞米松、PEG-DXM/DXM載藥膠束和SA-PEG-DXM/DXM載藥膠束在模型動物的體內藥效。分別在給藥后第2 d和第7 d對模型動物腎臟指數(shù)、腎功能指標、炎癥因子和氧化應激水平進行考察,結果發(fā)現(xiàn)給藥后第2d,SA-PEG-DXM/DXM載藥膠束明顯減輕動物腎臟水腫、降低血肌酐和尿素氮水平、抑制炎癥因子產生及改善氧化應激狀態(tài),并且在第7 d的療效更為顯著。采用HE和PAS染色法對模型動物腎臟組織病理形態(tài)進行考察,SA-PEG-DXM/DXM載藥膠束較其他制劑更為有效地改善小鼠腎臟組織腎小管擴張、腎間質水腫和炎癥細胞浸潤等。采用TUNEL法和免疫印跡法對腎臟組織細胞凋亡情況進行考察,結果同樣顯示SA-PEG-DXM/DXM載藥膠束顯著可改善改善腎臟組織細胞凋亡程度。在唾液酸介導的藥物遞送系統(tǒng)成功實現(xiàn)急性腎損傷靶向治療的基礎上,以對炎癥微環(huán)境中高濃度的基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)特異性敏感的PVGLIG多肽作為葡聚糖和姜黃素間的鏈段,合成唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黃素(SA-DEX-PVGLIG-CUR)聚合物前藥。采用熒光分光光度法測得SA-DEX-PVGLIG-CUR聚合物前藥中姜黃素的含量為5.38 ± 0.25%,體外釋放實驗證實SA-DEX-PVGLIG-CUR聚合物前藥在MMP-2酶的作用下可有效釋放藥物,姜黃素在48 h內的累積釋放量達到84.4 ± 5.1%,而對MMP-2酶無響應性SA-DEX-CUR聚合物前藥在同時間的累積釋放量僅為63.2 ± 4.8%。在脂多糖預處理的血管內皮細胞(HUVECs)和腎小管上皮細胞(HK-2)共培養(yǎng)體系中,SA-DEX-PVGLIG-CUR可主動靶向于炎癥HUVECs;AKI模型動物體內分布結果顯示,唾液酸介導的聚合物前藥具有良好的腎臟靶向能力:給藥后24 h,SA-DEX-PVGLIG-CUR在腎臟的分布量分別是游離姜黃素和DEX-PVGLIG-CUR的16.2倍和3.1倍,并且在腎臟的維持時間超過48 h。在炎癥微環(huán)境中MMP-2酶作用下,SA-DEX-PVGLIG-CUR還可響應性地釋放出游離姜黃素,增加藥物在HK-2細胞中的分布。采用激光共聚焦顯微鏡同樣觀察到在給予SA-DEX-PVGLIG-CUR的模型動物腎小管中姜黃素的分布量要明顯高于SA-DEX-CUR,從細胞和動物水平證明具有炎癥微環(huán)境響應性釋藥特征的SA-DEX-PVGLIG-CUR可增加藥物在腎臟部位其他功能細胞中的藥物分布。采用ICR小鼠為模型動物,通過腎臟注射LPS構建AKI動物模型,通過尾靜脈注射給藥,考察游離姜黃素、SA-DEX-CUR和SA-DEX-PVGLIG-CUR的體內療效。給藥48 h后,各項體內藥效學評價指標證明SA-DEX-PVGLIG-CUR對AKI具有最佳的治療效果,包括腎臟指數(shù)、腎功能指標、炎癥因子、氧化應激及組織病理學形態(tài)。綜上所述,本課題所設計的唾液酸-聚乙二醇-地塞米松載藥膠束和唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黃素聚合物前藥在急性腎損傷模型小鼠體內,通過其良好的腎臟分布和釋藥特性,提高藥物的治療效果。有望通過藥物的腎臟靶向蓄積,減少給藥頻率,實現(xiàn)對急性腎損傷的安全、有效治療。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R943

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本文編號：2791584