【摘要】：研究背景:心腦血管疾病是人類致死和致殘的主要原因之一。盡管人們在心血管疾病的診斷和治療方面已做了堅持不懈的努力,但由于對發(fā)病機(jī)制認(rèn)識的局限性,對心腦血管疾病的早期診斷、有效治療和預(yù)防控制尚不滿意。血栓在心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中十分重要,是導(dǎo)致心肌梗塞和缺血性卒中的主要因素。血小板活化在血栓形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此,研究抗血小板藥物及其作用機(jī)制,有助于防治心腦血管疾病、降低發(fā)病率和死亡率、改善人民健康和生活質(zhì)量。Humanin是一種具有抗凋亡作用的神經(jīng)肽,其高效突變衍生物S14G humanin(HNG)的抗凋亡活性比HN高1000倍,不僅能阻斷致阿爾茨海默病(FAD)因子-β淀粉樣肽(Aβ)引起的細(xì)胞死亡,而且對缺血性卒中、心肌缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化均有保護(hù)作用。血小板參與上述疾病的發(fā)病過程,提示HNG也可能通過影響血小板參與這些疾病。因此,本課題探討HNG對血小板活化,動脈血栓形成和器官損傷后血栓炎癥的作用及機(jī)制。研究目的:探究HNG是否影響血小板活化及其作用靶點,是否影響血栓形成和器官損傷導(dǎo)致的血栓性炎癥。研究方法:1、研究HNG對血小板活化的影響。(1)血小板聚集實驗:用HNG或?qū)φ杖軇╊A(yù)處理膠過濾分離的人血小板10分鐘,然后在血小板聚集儀中,用血小板激動劑(包括膠原,CRP,凝血酶,AYPGQV或ADP)刺激5分鐘,分別得到血小板聚集曲線。(2)血小板顆粒釋放:取人膠過濾血小板,用HNG或?qū)φ杖軇╊A(yù)處理10分鐘后,用血小板聚集儀檢測ATP釋放(致密顆粒釋放);用流式細(xì)胞儀檢測血小板表面P-selectin的表達(dá)(α顆粒釋放)。(3)血小板內(nèi)向外和外向內(nèi)信號通路:取人膠過濾血小板,用HNG或?qū)φ杖軇╊A(yù)處理10分鐘后,分別檢測:內(nèi)向外信號通路,利用流式細(xì)胞儀檢測血小板表面整合素αIIbβ3的活化。外向內(nèi)信號通路,活化的血小板整合素αIIbβ3觸發(fā)血小板外部信號傳導(dǎo),包括血栓穩(wěn)定所必需的激酶級聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞骨架重組。為了評估HNG是否影響血小板外向內(nèi)信號,將預(yù)處理的血小板在固定的纖維蛋白原上鋪展和粘附,一定時間后用細(xì)胞骨架染料鬼筆環(huán)肽染色,計算血小板鋪展后的面積。(4)血小板信號分子磷酸化:利用免疫印跡Western blot方法檢測了HNG預(yù)處理后血小板內(nèi)信號分子的磷酸化水平的變化。2、研究HNG對血栓形成的影響以及出血傾向。為了探索HNG對血栓形成和穩(wěn)定的影響,我們將從體外和體內(nèi)兩方面入手,體外通過流體小室(flow chamber),體內(nèi)通過頸動脈損傷血栓模型來檢測HNG在血栓形成中的作用。(1)流體小室實驗(Flow chamber):本實驗使用的儀器是BioFlux200系統(tǒng)。BioFlux孔板通道先用200μg/ml的Ⅰ型膠原蛋白包被1小時。取檸檬酸鈉抗凝的人全血,并用熒光劑Calcein-AM標(biāo)記,在10dyn/cm~2的剪切應(yīng)力下使血小板在膠原包被的表面上流動,用倒置熒光顯微鏡記錄血小板在孔板通道中的聚集反應(yīng)。(2)氯化鐵誘導(dǎo)頸動脈損傷模型:本研究將利用氯化鐵誘導(dǎo)頸動脈損傷模型觀察HNG預(yù)處理后大動脈的血栓形成。方法:鈍性剝離小鼠的左頸動脈,7.5%FeCl3浸泡2分鐘。用Visual Sonics View 2100超聲儀的多普勒模式探測器記錄動脈血流30分鐘,觀察損傷30分鐘內(nèi)血管有無阻塞和初次阻塞所需時間。本實驗的動脈損傷模型比較簡單,但是每只小鼠的個體差異都是一個陷阱。所以,要使用相對大量的小鼠,每組至少10只小鼠。(3)對生理止血的影響:剪尾出血實驗:麻醉小鼠后,剪掉5mm尾巴,立即放入37℃生理鹽水中,觀察其尾部出血時間,記錄第一次出血時間以及再次出血時間及其間隔。HNG給藥組和對照組小鼠每組至少10只。3、檢測HNG在心肌缺血再灌注(I/R)誘導(dǎo)的血栓炎癥中的作用:越來越多的實驗證據(jù)表明,血小板是免疫細(xì)胞庫的一部分,特別是血小板和白細(xì)胞之間的相互結(jié)合影響著炎癥組織的損傷程度,成為免疫反應(yīng)的共同特征。本課題研究了HNG對心肌缺血再灌注后血栓炎癥的影響。(1)小鼠心肌缺血再灌注損傷模型:手術(shù)前1小時腹腔注射HNG(0.2mg/kg)或生理鹽水對照,然后進(jìn)行心肌缺血手術(shù)以及假手術(shù)(sham)對照組,缺血45分鐘后再灌注10分鐘或2小時,取全血和心臟,進(jìn)行后續(xù)試驗檢測,其中,使用伊萬斯藍(lán)Evans Blue和TTC染色確定心臟梗死面積。心肌未染藍(lán)色區(qū)域(危險區(qū)域,AAR),心肌Evans Blue染藍(lán)色區(qū)域(非危險區(qū)域,ANAR),TTC染色區(qū)域(紅色)以及TTC未染色區(qū)域(梗死區(qū)域IA,白色)均使用Image J軟件進(jìn)行分析處理。心肌梗死面積用梗死區(qū)域與危險區(qū)域(AAR)的百分比(IA/AAR)來表示,而AAR面積則通過AAR與左心室總面積(AAR/AAR+ANAR)之間的比例來表示。(2)HNG對心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的血栓炎癥的影響:本課題利用流式細(xì)胞儀分別檢測心肌缺血再灌注后,HNG對小鼠體循環(huán)血液中血小板P-selectin表達(dá),活性氧ROS的產(chǎn)生以及血小板-白細(xì)胞聚集體的影響。4、評估HNG在血小板上的作用靶點:(1)篩選HNG在血小板上的靶點:本課題使用親和素-抗親和素純化的方法將血小板上可能與HNG結(jié)合的蛋白篩選出來,然后進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定HNG的潛在靶點,并對質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行KEGG通路富集分析、GO功能分析和蛋白相互作用(PPI分析)等生物信息學(xué)分析。(2)分子對接:HNG(2GD3)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型由RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載。人β1微管蛋白結(jié)構(gòu)由ModBase server人β2微管蛋白晶體結(jié)構(gòu)(RCSB PDB:4I4T)同源重構(gòu)得到。HNG-tubulinβ1結(jié)合用ZDOCK(http://zdock.umassmed.edu/)軟件完成,并通過FiberDock評分(http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/FiberDock/)。(3)免疫沉淀和免疫熒光實驗評估HNG能否通過靶向微管蛋白β1-tubulin發(fā)揮穩(wěn)定血小板微管的作用:親和純化和免疫印跡實驗:將生物素標(biāo)記的HNG與血小板裂解液孵育后,用抗生物素的瓊脂糖純化與HNG結(jié)合的蛋白,做免疫印跡實驗,用微管蛋白β-tubulin雜交。免疫熒光實驗:膠過濾的血小板與HNG孵育后,然后用β1-tubulin抗體進(jìn)行染色,并使用激光共聚焦拍照,觀察HNG與β1-tubulin的共定位。微管解聚測定:將HNG預(yù)處理的血小板與微管解聚藥,諾考達(dá)唑,在37℃下孵育�；蛘�,在固定之前使血小板粘附于纖維蛋白原包被的載玻片。使用抗β1-微管蛋白和抗乙酰化微管蛋白的抗體染色,觀察微管解聚情況。研究結(jié)果:1、HNG抑制血小板活化。(1)HNG抑制血小板聚集:為了確定HNG對血小板功能的影響,將分離的人血小板與HNG或?qū)φ杖軇╊A(yù)孵育,并用膠原,convulxin,凝血酶和AYPGQV等激動劑刺激血小板。結(jié)果顯示:HNG劑量依賴性地抑制膠原引起的血小板聚集,在10μM時聚集減少58%(P0.01,每組n=8)。HNG也抑制由convulxin(P0.01),ADPAYPGQV(P0.05)和凝血酶(P0.05)引起的血小板聚集。(2)HNG抑制血小板P-選擇素表達(dá)和ATP分泌:血小板激活導(dǎo)致以表面P-選擇蛋白表達(dá)為特征的α-顆粒的胞吐作用。流式實驗結(jié)果顯示,HNG顯著抑制了convulxin誘導(dǎo)的P-選擇素表達(dá)增加(P0.01)。此外,我們還評估了血小板致密顆粒中ATP的釋放,與對照組相比,HNG處理血小板后能顯著降低膠原和convulxin誘導(dǎo)的ATP釋放(分別是P0.05和P0.01)(3)HNG抑制血小板整合素αIIbβ3活化以及在纖維蛋白原上的鋪展:流式細(xì)胞術(shù)實驗結(jié)果顯示與scramble-HNG組及溶劑對照組相比,HNG顯著降低了蛇毒convulxin和CRP誘導(dǎo)的血小板表面纖維蛋白原水平,即整合素αIIbβ3的活化(P0.05)。血小板鋪展實驗結(jié)果顯示與HNG孵育后也能顯著降低血小板的鋪展面積(P0.05)。(4)HNG抑制血小板中Akt/Erk1/2信號傳導(dǎo):由于HNG能夠抑制由不同激動劑誘導(dǎo)的血小板聚集,因此我們探討了其抗血小板的細(xì)胞內(nèi)激酶信號傳導(dǎo)。免疫印跡實驗結(jié)果顯示,HNG能顯著降低由膠原誘導(dǎo)的Akt和Erk1/2的磷酸化水平。同時HNG能輕度降低p38MAPK的磷酸化,但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義。2、HNG發(fā)揮抗血栓作用且在有效作用劑量是不增加出血風(fēng)險的。(1)HNG抑制在流動條件下膠原蛋白上的血小板粘附:流動小室實驗顯示HNG顯著降低膠原表面的血小板粘附(P0.01)。(2)HNG抑制體內(nèi)血栓形成:我們檢測了HNG在小鼠頸動脈損傷模型中的抗血栓作用。頸動脈血流的超聲觀察顯示小鼠腹腔注射HNG(25μg/kg,n=13)后,能夠延長初始血栓的閉塞時間(P0.05)。(3)HNG不增加出血風(fēng)險:為了確定HNG對止血的作用,我們進(jìn)行了小鼠尾部出血和頸靜脈出血測定。與對照組相比,HNG處理組小鼠的出血時間并沒有明顯延長。3、HNG能降低心肌缺血再灌注小鼠的血栓性炎癥損傷。(1)TTC染色發(fā)現(xiàn)HNG降低了小鼠I/R后心臟的梗塞面積(P0.05)。(2)利用流式細(xì)胞術(shù)實驗發(fā)現(xiàn),HNG減弱了I/R損傷后的血栓炎癥。HNG能降低心肌I/R后引起的循環(huán)血小板P-選擇素表達(dá)(P0.01),活性氧ROS產(chǎn)生(P0.01)和血小板-白細(xì)胞聚集物增加(P0.05)。4、HNG可能與血小板β1-微管蛋白結(jié)合并穩(wěn)定血小板微管。(1)質(zhì)譜:我們使用生物素-抗生物素蛋白親和純化實驗從人血小板中提取出HNG潛在的結(jié)合蛋白,并進(jìn)行銀染、切膠、質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)了幾種與HNG結(jié)合可能性較大的蛋白,包括在血小板功能和AZD中都發(fā)揮重要作用的β1-微管蛋白。(2)分子對接揭示HNG與β1-微管蛋白結(jié)合,并且結(jié)合位點與現(xiàn)有的微管穩(wěn)定劑紫杉酚結(jié)合位點不同。(3)使用生物素-抗生物素蛋白親和純化從人血小板中取出HNG結(jié)合蛋白,并且使用免疫共沉淀western印跡發(fā)現(xiàn)HNG與β1-微管蛋白結(jié)合。(4)通過共聚焦免疫熒光染色觀察到在血小板中β1微管蛋白與HNG存在共定位。(5)HNG抑制血纖維蛋白原刺激的血小板微管解聚或微管去穩(wěn)定劑諾考達(dá)唑處理引起的微管解聚。研究結(jié)論:1、HNG抑制血小板活化和血栓形成,且無明顯出血傾向。2、HNG的作用機(jī)制可能是穩(wěn)定微管,其抑制血小板活化的其中一個靶點可能是β1-微管蛋白。3、HNG可能通過抑制血小板活化來抑制血栓炎癥發(fā)揮心肌缺血的保護(hù)作用。4、這些發(fā)現(xiàn)提示了HNG在心腦血管疾病防治中的潛在應(yīng)用前景。為未來HNG作為抗血小板抗血栓藥物的轉(zhuǎn)化開發(fā)提供了新的實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96
【圖文】：

一、HNG 抑制血小板活化1.HNG 抑制血小板聚集血小板聚集實驗是反映體外血小板活化功能最重要的指標(biāo)，因此，為了檢測HNG 對血小板功能是否有影響，我們將分離人膠過濾血小板（2×108/ml）與 HNG（4, 8,10μM）或?qū)φ杖軇┧?37℃預(yù)孵育 10 分鐘，并用血小板刺激劑，膠原，convulxin，凝血酶和蛋白酶活化受體 PAR4 刺激劑 AYPGQV 等刺激血小板活化。結(jié)果顯示 HNG 劑量依賴性地抑制各種刺激劑引起的血小板聚集。其中，2μg/ml膠原引起的血小板聚集，在 HNG10μM 處理后聚集減少了 58％（P<0.01,每組 n =8）。 此外，HNG 也能抑制由 4nM 蛇毒 convulxin（P<0.01），300μM AYPGQV（P<0.05）和 0.01U 凝血酶（P<0.05）引起的血小板聚集（見圖 1）。以上結(jié)果證明 HNG 能抑制 ITAM 受體和 G 蛋白偶聯(lián)受體引起的血小板聚集。

34圖 2 HNG 對血小板 α 顆粒和致密顆粒分泌的影響。流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測血小板 P-選擇蛋白的表達(dá)。（A，B）圖示峰形圖是三個獨立實驗的代表圖。 統(tǒng)計圖是平均值±SEM；n=3。* P<0.05， ** P<0.01，非配對 t 檢驗。（C）血小板活化釋放 ATP。圖 3C 分別是在膠原和 convulxin 刺激下血小板釋放 ATP 的曲線圖，為 3 次以上實驗中的一次代表圖。統(tǒng)計圖是根據(jù) ATP 標(biāo)準(zhǔn)品計算的 ATP 釋放量（nmol），是平均值±SEM; n≥3;* P<0.05，配對 t 檢驗。3. HNG 抑制血小板整合素 αIIbβ3 的活化以及在纖維蛋白原上的鋪展前面的實驗結(jié)果已經(jīng)顯示 HNG 能抑制血小板的顆粒釋放，接下來，為了測試HNG 是否影響血小板整合素 αIIbβ3（在血小板活化過程中的一個關(guān)鍵步驟）的內(nèi)向外活化，我們將人膠過濾的血小板先與 HNG 或溶劑對照在 37℃預(yù)孵育 10 分鐘，

34圖 2 HNG 對血小板 α 顆粒和致密顆粒分泌的影響。流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測血小板 P-選擇蛋白的表達(dá)。（A，B）圖示峰形圖是三個獨立實驗的代表圖。 統(tǒng)計圖是平均值±SEM；n=3。* P<0.05， ** P<0.01，非配對 t 檢驗。（C）血小板活化釋放 ATP。圖 3C 分別是在膠原和 convulxin 刺激下血小板釋放 ATP 的曲線圖，為 3 次以上實驗中的一次代表圖。統(tǒng)計圖是根據(jù) ATP 標(biāo)準(zhǔn)品計算的 ATP 釋放量（nmol），是平均值±SEM; n≥3;* P<0.05，配對 t 檢驗。3. HNG 抑制血小板整合素 αIIbβ3 的活化以及在纖維蛋白原上的鋪展前面的實驗結(jié)果已經(jīng)顯示 HNG 能抑制血小板的顆粒釋放，接下來，為了測試HNG 是否影響血小板整合素 αIIbβ3（在血小板活化過程中的一個關(guān)鍵步驟）的內(nèi)向外活化，我們將人膠過濾的血小板先與 HNG 或溶劑對照在 37℃預(yù)孵育 10 分鐘，

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4 李生

本文編號：2791526