【摘要】：氧釩配合物是非常重要的一類高價過渡金屬配合物,具有抗腫瘤、抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生蟲、催化劑、降低高脂血癥和高血壓以及胰島素增強作用等多種生物活性。近年來的研究表明,氧釩配合物作用于腫瘤細胞的IC_(50)(μM范圍)低,而且具有促細胞凋亡和抗增殖作用。因此,深入研究此類配合物的抗腫瘤特性及其機制具有重要的意義,其研究結(jié)果可為進一步的臨床應用提供重要的實驗基礎。在該類化合物的抗腫瘤作用機制方面,雖然已經(jīng)提出了幾種途徑,以闡述氧釩配合物對腫瘤細胞周期的抑制和誘導細胞凋亡的機制,但其真正的機理仍未完全清楚。為了進一步了解氧釩配合物的生物活性及其作用機理,本文設計、合成了一系列含1,10-菲羅啉衍生物配體的新型氧釩(Ⅳ)配合物,并通過相關生物實驗對其抗腫瘤活性和機制進行較深入的探討。本文的主要研究工作如下:1.設計合成了以吡哆醛縮氨基硫脲類席夫堿為主配體,1,10-菲羅啉為輔助配體的四種新型氧釩(Ⅳ)配合物,即[VO(Hthpy)(phen)](1)、[VO(Hpthpy)(phen)](2)、[VO(Hmthpy)(phen)](3)和[VO(Hethpy)(phen)](4)。以元素分析、UV-Vis、IR、ESI-MS和核磁共振等方法表征其結(jié)構(gòu)。2.設計合成了以鄰羥基苯乙酮縮氨基硫脲類席夫堿為主配體,1,10-菲羅啉為輔助配體的三種新型氧釩(Ⅳ)配合物,即[VO(HoHAT)(phen)](5)、[VO(HoHMT)(phen)](6)和[VO(HoHET)(phen)](7)。以元素分析、UV-Vis、IR、ESI-MS和核磁共振等方法表征其結(jié)構(gòu)。3.設計合成了以吡哆醛異煙酰腙席夫堿為主配體,1,10-菲羅啉并咪唑衍生物為輔助配體的三種新型氧釩(Ⅳ)配合物,即[VO(PIH)(FPIP)](8)、[VO(PIH)(ClPIP)](9)和[VO(PIH)(OHPIP)](10)。以元素分析、UV-Vis、IR、ESI-MS和核磁共振等方法表征其結(jié)構(gòu)。4.通過UV-Vis光譜滴定、熒光光譜滴定及瓊脂糖凝膠電泳實驗研究了上述新型配合物與DNA的相互作用。實驗證實,這些配合物通過插入結(jié)合模式與DNA結(jié)合。在生理條件下,均可有效切割質(zhì)粒DNA,顯示出良好的化學核酸酶的活性。采用熒光光譜法測試了它們與BSA的相互作用。結(jié)果顯示,此類配合物與蛋白質(zhì)具有良好的結(jié)合傾向。5.通過一系列體外實驗,研究了新型配合物的抗腫瘤活性并對它們的抗腫瘤機制進行了探討。(1)采用MTT法評估了配合物對肺癌細胞(A549)、宮頸癌細胞(Hela)和肝癌細胞(HepG2)的體外抗腫瘤活性。結(jié)果顯示,所選癌細胞的生長均受到顯著的抑制,新型配合物對腫瘤細胞的抑制率與臨床藥物順鉑的抑制率相當,部分化合物甚至高于順鉑。(2)通過AO/EB和Hoechst 33342染色實驗觀察到經(jīng)配合物作用后的腫瘤細胞表現(xiàn)出明顯的凋亡狀態(tài)。使用流式細胞儀對配合物作用后腫瘤細胞的細胞周期和凋亡進行了測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些配合物可阻滯腫瘤細胞的分裂周期停滯在某個階段并且能誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。(3)使用熒光顯微鏡和流式細胞儀對細胞內(nèi)的活性氧含量和線粒體膜電位進行定性和定量分析。結(jié)果顯示,所測配合物均使腫瘤細胞內(nèi)的活性氧水平顯著升高,而線粒體膜電位則顯著降低。這些實驗結(jié)果提示,此類配合物誘導腫瘤細胞凋亡的機制可能是:配合物作用于腫瘤細胞后,使細胞內(nèi)的活性氧含量增多,造成線粒體膜氧化性損傷以及通透性改變,從而導致了線粒體膜電位的降低,最終引起細胞凋亡。(4)為了進一步探索此類配合物抗腫瘤活性的作用機制,本文選取了Bax、Bcl-2、C-myc和p57~(Kip2)四種與細胞周期阻滯和細胞凋亡相關的基因作為目標靶點,采用Q-PCR技術(shù)從基因水平上進行驗證實驗。結(jié)果顯示,所選的配合物能使促凋亡基因Bax和抑癌基因p57~(Kip2)的表達水平顯著增高,而抗凋亡基因Bcl-2和C-myc的表達水平降低。(5)采用Western Blot技術(shù)從分子層面上進行了探究,結(jié)果表明:配合物能對Bax和p57~(Kip2)這兩種蛋白的表達產(chǎn)生上調(diào)作用,對Bcl-2蛋白的表達產(chǎn)生下調(diào)作用。基于上述實驗結(jié)果,本文證實了此類新型氧釩配合物具有良好的抗腫瘤活性。它們誘導腫瘤細胞凋亡的機制可能為如下途徑:氧釩配合物可能是通過ROS介導的線粒體途徑誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡并抑制腫瘤侵襲。配合物作用腫瘤細胞后,引起細胞內(nèi)的活性氧增多,從而激活了促凋亡蛋白Bax的表達,同時抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,促使線粒體膜上形成離子通道,引起線粒體通透性改變,從而釋放出線粒體中的凋亡相關活性物質(zhì),最終導致細胞發(fā)生凋亡;另一方面,配合物的介入激活了抑癌因子p57~(Kip2)的表達,從而抑制了細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的功能,使細胞周期停滯于G_1期,而不能順利進入S期,細胞增殖受到抑制,最終達到抑制腫瘤侵襲的作用。
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914;R96
【圖文】：

圖 2-1 吡哆醛縮氨基硫脲類氧釩(IV)配合物的結(jié)構(gòu)Fig.2-1 The structures of pyridoxal thiosemicarbazone oxovanadium (IV) complexes

廣東藥科大學碩士研究生畢業(yè)論文2.3 結(jié)果與討論2.3.1 氧釩(IV)配合物與 DNA 的相互作用2.3.1.1 UV-Vis 光譜滴定紫外-可見分光光度法是研究化合物與 DNA 相互作用的基本且有效的方法[36]。四種含吡哆醛縮氨基硫脲類席夫堿配體的氧釩(IV)配合物[VO(Hthpy)(phen)] (1)、[VO(Hpthpy)(phen)] (2)、[VO(Hmthpy)(phen)] (3)和[VO(Hethpy)(phen)] (4)與 CT-DNA相互作用的紫外吸收光譜圖如圖 2-10 所示。

圖 2-11 配合物 1(a)、2(b)、3(c)和 4(d)與 CT-DNA 作用的熒光光譜圖Fig.2-11 The fluorescence spectra for the interaction of complexes 1(a), 2(b), 3(c) and 4(d) withCT-DNA從圖 2-11 可以看出，四種配合物的熒光強度隨著 CT-DNA 的加入而增強，表明配合物與 CT-DNA 發(fā)生了結(jié)合作用。其熒光光譜變化值如表 2-6 所示。表 2-6 四種配合物與 CT-DNA 作用的熒光光譜變化值Table 2-6 The changes of fluorescence spectra for the interaction of four complexes with CT-DNA配合物 未加 DNA 的樣品 加入 DNA 后的樣品 F/F0λem，max/nm F0λem，max/nm FVO(Hthpy)(phen) 724.0 327.14 724.0 476.02 1.46VO(Hpthpy)(phen) 735.0 251.29 735.0 330.49 1.32VO(Hmthpy)(phen) 705.0 282.67 705.0 460.67 1.63

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本文編號：2789568