【摘要】：【研究背景】Cathelicidin抗菌肽是一類具有廣譜抗菌活性的陽離子肽。Cathelicidin抗菌肽目前僅一種,在小鼠為CRAMP,在人為LL-37。Cathelicidin主要由組織細(xì)胞(如上皮細(xì)胞)和免疫細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞等)表達(dá)。Cathelicidin抗菌肽通過正負(fù)靜電吸引作用結(jié)合并破壞帶負(fù)電的細(xì)菌胞壁或膜結(jié)構(gòu)從而發(fā)揮抗菌功能。因此Cathelicidin還具有抵御有包膜病毒如呼吸道合胞病毒、流感病毒的功能。然而,Cathelicidin抗菌肽對于非包膜病毒的作用及機(jī)制研究甚少。B3柯薩奇病毒(Coxsackievirus B3,CVB3)是引起病毒性心肌炎(Viral Myocarditis,VMC)的非包膜小RNA病毒。我們實驗室先期研究發(fā)現(xiàn),抗菌肽cathelicidin能在體內(nèi)外顯著抑制非包膜病毒CVB3在心肌細(xì)胞的復(fù)制,顯著減輕CVB3誘導(dǎo)的急性心肌炎。為闡明cathelicidin抗非包膜病毒的機(jī)制,我們在體外原代心肌細(xì)胞證實外源加入cathelicidin具有劑量依賴的抗病毒作用。然而,隨后在CVB3感染機(jī)體的初始組織-腸道上皮細(xì)胞HCT116和CVB3研究常用宮頸癌上皮細(xì)胞系Hela中的試驗,卻意外發(fā)現(xiàn)外源加入抗菌肽cathelicidin可劑量依賴地顯著促進(jìn)CVB3在上皮細(xì)胞的復(fù)制。CVB3是腸道病毒,感染人體時首先感染腸道上皮細(xì)胞,隨后經(jīng)大網(wǎng)膜入血后再后續(xù)感染胰腺和心臟誘導(dǎo)心肌炎和胰腺炎,因此CVB3在腸道上皮細(xì)胞的復(fù)制是整個CVB3感染致病的首要過程,對后續(xù)多臟器的CVB3感染復(fù)制和炎癥疾病有顯著的影響。而抗菌肽cathelicidin又是上皮細(xì)胞等分泌的抗感染固有免疫效應(yīng)分子。則我們認(rèn)為cathelicidin顯著促進(jìn)CVB3在腸道上皮細(xì)胞的復(fù)制是一個重要的科學(xué)問題。需要深入研究和機(jī)制探討。本課題聚焦cathelicidin抗菌肽對于非包膜病毒CVB3的作用及其分子機(jī)制,特別專注于我們發(fā)現(xiàn)的cathelicidin抑制心肌細(xì)胞內(nèi)CVB3復(fù)制然而促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞內(nèi)CVB3病毒復(fù)制的反常規(guī)現(xiàn)象,擬首先通過外源加入cathelicidin抗菌肽和CRISPR/Cas9敲除細(xì)胞內(nèi)源性cathelicidin明確cathelicidin促進(jìn)腸上皮細(xì)胞CVB3復(fù)制的現(xiàn)象。進(jìn)一步,將對病毒感染細(xì)胞和復(fù)制的多個步驟及相關(guān)細(xì)胞自噬、凋亡等行為進(jìn)行研究,試圖闡明cathelicidin抗菌肽促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞CVB3復(fù)制的分子機(jī)制。本研究系首次發(fā)現(xiàn)和研究抗菌肽促進(jìn)病毒復(fù)制的現(xiàn)象和機(jī)制,有助于揭示抗菌肽在非包膜病毒感染上皮細(xì)胞的作用和機(jī)制,從而為闡明CVB3誘導(dǎo)的急性病毒性心肌炎機(jī)制提供新的切入點(diǎn)和思路;同時為抗菌肽在抗病毒免疫治療的應(yīng)用提供新視點(diǎn)。【目的】明確抗菌肽cathelicidin促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞內(nèi)CVB3復(fù)制的現(xiàn)象及分子機(jī)制�！狙芯糠椒ā�1.原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng):取出生24小時乳鼠心臟,以膠原酶II和透明質(zhì)酸酶37℃消化2~3輪,將消化獲得細(xì)胞通過差速貼壁法獲得心肌細(xì)胞,以DMEM-10%FBS培養(yǎng)24hr備用。2.腸道上皮細(xì)胞的培養(yǎng):結(jié)腸癌上皮細(xì)胞HCT116以DMEM-10%FBS 37℃培養(yǎng)。胰蛋白酶消化傳代。3.CVB3體外細(xì)胞感染試驗:以100μl CVB3(MOI=10)感染細(xì)胞,37℃1小時,棄液,無菌PBS洗一遍,DMEM-2%FBS維持液維持。4.CVB3復(fù)制蛋白水平的檢測:蛋白免疫印跡檢測CVB3衣殼蛋白VP1:CVB3感染細(xì)胞以預(yù)冷RIPA裂解,上清蛋白測濃度后煮沸。蛋白樣品行SDS-PAGE電泳,條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%BSA封閉2 h。兔抗VP1抗體4℃孵育過夜;二抗室溫孵育1.5 h,ECL化學(xué)發(fā)光顯色,膠片壓片,顯影定影。5.CVB3復(fù)制RNA水平的檢測:熒光定量PCR檢測CVB3正負(fù)鏈:RNAiso提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)成cDNA,SYBR Green實時定量PCR。2~(-??CT)方法計算病毒正負(fù)鏈的相對表達(dá)。6.CVB3活性顆粒的效價檢測:TCID_(50)方法檢測病毒效價:細(xì)胞培養(yǎng)上清按10~(-1)-10~(-10)稀釋,加30μl至Hela細(xì)胞,每天觀察,半數(shù)細(xì)胞折光性變差、皺縮、浮起50時判為病變。按照TCID_(50)=lg(大于50%病變陽性率的稀釋度)+(大于50%病變陽性率的百分?jǐn)?shù)-50)/(大于50%病變陽性率的百分?jǐn)?shù)-小于50%病變陽性率的百分?jǐn)?shù))。將30μl病毒液數(shù)值換算為100μl病毒液數(shù)值。換算PFU/ml≈TCID50/ml%s0.7。7.CRISPR/CAS9技術(shù)敲除細(xì)胞內(nèi)源性cathelicidin:HCT116細(xì)胞構(gòu)建嘌呤霉素抗性的cas9細(xì)胞株,篩選陽性克隆,用設(shè)計的LV-sgRNA感染cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,熒光篩選胞內(nèi)敲除cathelicidin。8.病毒吸附細(xì)胞和穿入細(xì)胞的檢測:吸附試驗:4℃預(yù)冷,CVB3(MOI=20)感染細(xì)胞,同時加LL37,4℃置1h使病毒結(jié)合細(xì)胞無法進(jìn)入胞內(nèi)。棄上清洗三遍,加DMEM-10%FBS繼續(xù)培養(yǎng)18h收細(xì)胞蛋白。病毒穿入細(xì)胞試驗:4℃預(yù)冷,CVB3(MOI=20)感染細(xì)胞,4℃置1h使吸附,棄上清洗三遍,加DMEM-10%FBS,同時加LL37,37℃培養(yǎng)1h,棄上清洗三遍,DMEM-10%FBS 37℃培養(yǎng)18h收細(xì)胞蛋白。9.細(xì)胞自噬的檢測:蛋白免疫印跡檢測自噬相關(guān)蛋白LC3:CVB3感染細(xì)胞0,2,4,6,8h收細(xì)胞蛋白。SDS-PAGE,轉(zhuǎn)PVDF膜,5%BSA封閉;兔抗LC3I/II抗體4℃孵育過夜;二抗孵育1.5 h,ECL化學(xué)發(fā)光顯色。免疫熒光檢測LC3:CVB3感染細(xì)胞6h棄上清,4%多聚甲醛室溫固定15分鐘,0.25%TRITON?X-100破膜5分鐘,10%BSA封閉30分鐘,兔抗LC3I/II抗體37℃孵育2小時,二抗37℃ 45分鐘。DAPI室溫10分鐘染胞核,激光共聚焦顯微鏡下觀察。10.流式檢測細(xì)胞凋亡:重懸CVB3感染細(xì)胞,加Annexin V-APC和7-AAD,室溫避光孵育15分鐘。上機(jī)檢測。11.蛋白免疫印跡檢測ERK信號通路和AKT信號通路相關(guān)蛋白:CVB3感染HCT116細(xì)胞0~18hr,收細(xì)胞蛋白,SDS-PAGE,轉(zhuǎn)PVDF膜,以ERK,p-ERK,AKT,p-AKT,mTOR,p-mTOR等抗體檢測相關(guān)蛋白。12.統(tǒng)計方法:數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;組間比較采用方差分析;分析以GraphPad Prism 5和SPSS 11軟件完成,P0.05存在顯著性差異�！窘Y(jié)果】1.5~20μg/mL的LL37和CRAMP抗菌肽對細(xì)胞無毒性。2.以CVB3感染(MOI=10)原代心肌細(xì)胞,外源加入Cathelicidin抗菌肽可劑量依賴地抑制CVB3在原代心肌細(xì)胞的復(fù)制。2、Cathelicidin抗菌肽可劑量依賴地顯著促進(jìn)CVB3在腸道上皮細(xì)胞HCT116的復(fù)制。以GFP-CVB3或CVB3感染(MOI=10)HCT116,同時加入5~20μg/m L抗菌CRAMP和LL37,以亂序無功能的s LL-37與sCARMP為對照,發(fā)現(xiàn):1)流式檢測GFP陽性細(xì)胞證實:CRAMP和LL37均可劑量依賴地促進(jìn)胞內(nèi)熒光CVB3的增加;2)CVB3感染18小時,western blot檢測CVB3衣殼蛋白VP1水平,發(fā)現(xiàn)LL37和CRAMP顯著上調(diào)VP1表達(dá),且具有劑量依賴性;3)感染18小時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)2種抗菌肽顯著提高CVB3的RNA復(fù)制與載量;4)細(xì)胞上清TCID50試驗發(fā)現(xiàn)20μg/m L的LL37和CRAMP可使CVB3在HCT116產(chǎn)生的活性病毒顆粒效價由10~5pfu顯著上升至10~7 pfu。證實Cathelicidin抗菌肽可劑量依賴地促進(jìn)CVB3在腸道上皮細(xì)胞的復(fù)制。3、Cathelicidin抗菌肽顯著促進(jìn)了CVB3在人宮頸癌上皮細(xì)胞HeLa、人肺癌上皮細(xì)胞A549和人腎上皮細(xì)胞HepG-2的復(fù)制,提示Cathelicidin抗菌肽促進(jìn)CVB3在上皮細(xì)胞的復(fù)制。4、CVB3感染腸道上皮細(xì)胞HCT116自4小時起,顯著上調(diào)了腸上皮細(xì)胞內(nèi)源性Cathelicidin抗菌肽的表達(dá)。5、以CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)建立穩(wěn)定敲除cathelicidin的HCT116-Cas9細(xì)胞株,再感染CVB3發(fā)現(xiàn):內(nèi)源性cathelicidin敲除后,CVB3感染18小時的衣殼蛋白VP1表達(dá)量顯著降低,病毒RNA復(fù)制量和載量顯著減少,上清活性病毒顆粒效價顯著降低。再次證實:Cathelicidin抗菌肽可顯著促進(jìn)CVB3在腸道上皮細(xì)胞的復(fù)制。6、從病毒細(xì)胞感染細(xì)胞過程探討了cathelicidin抗菌肽促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞CVB3復(fù)制的分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn):通過4℃條件CVB3孵育細(xì)胞1hr同時加抗菌肽(病毒吸附)隨后棄上清再培養(yǎng)試驗,和4℃條件CVB3孵育細(xì)胞1hr后棄上清、再加抗菌肽37℃孵育1hr、再培養(yǎng)試驗(病毒穿入細(xì)胞),發(fā)現(xiàn)cathelicidin能促進(jìn)CVB3的吸附細(xì)胞和穿入細(xì)胞的過程。7、CVB3感染細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞自噬促進(jìn)病毒復(fù)制,但在感染0~8hr,抗菌肽cathelicidin的加入不影響CVB3誘導(dǎo)的LC3I/LC3II比例上調(diào)即自噬發(fā)生。8、流式細(xì)胞術(shù)檢測Annexin V+7-AAD-早期凋亡細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)抗菌肽cathelicidin促進(jìn)CVB3感染細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。9、CVB3感染過程伴隨ERK磷酸化增加,抗菌肽cathelicidin的加入在前期增強(qiáng)p-ERK的激活,ERK信號通路抑制劑U0126顯著抑制LL37作用下CVB3復(fù)制,提示抗菌肽影響ERK通路激活。10、CVB3感染激活A(yù)KT信號通路啟動病毒RNA的轉(zhuǎn)錄翻譯。發(fā)現(xiàn):CVB3感染4hr時p-AKT尚未激活無VP1蛋白表達(dá);感染6hr才誘導(dǎo)p-AKT和病毒VP1表達(dá);加入cathelicidin抗菌肽不僅在6hr時顯著增強(qiáng)p-AKT激活、上調(diào)VP1蛋白水平;在感染4h就已顯著上調(diào)p-Akt水平、從而提前啟動了Akt通路激活介導(dǎo)的病毒RNA轉(zhuǎn)錄。提示抗菌肽cathelicidin能提前激活胞內(nèi)AKT通路,顯著促進(jìn)CVB3的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制�！窘Y(jié)論】1、抗菌肽cathelicidin在體內(nèi)外均顯著抑制CVB3在原代心肌細(xì)胞的復(fù)制,但是可顯著促進(jìn)CVB3在腸道上皮細(xì)胞的體外復(fù)制。2、敲除腸道上皮細(xì)胞內(nèi)源性cathelicidin,可顯著降低CVB3的復(fù)制。3、抗菌肽cathelicidin促進(jìn)CVB3在腸道上皮細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制的分子機(jī)制,主要通過促進(jìn)病毒吸附和穿入細(xì)胞、促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的早期凋亡、增強(qiáng)早起ERK磷酸化、提前激活胞內(nèi)Akt磷酸化、促進(jìn)CVB3的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制來實現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96
【圖文】：

cathelicidin 促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞內(nèi)無包膜病毒 CVB3 復(fù)制的作用和機(jī)制探討 第實驗數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；組間比較采用方差分析；統(tǒng)計分hPad Prism 5 和 SPSS 11 軟件完成，P<0.05 被認(rèn)為存在顯著性差異。3. 結(jié)果3.1 cathelicidin 抗菌肽顯著抑制 CVB3 在乳鼠原代心肌細(xì)胞中的復(fù)制取乳鼠的原代心肌細(xì)胞，鋪板 24 小時至完全貼壁，光鏡下可見細(xì)胞有動。用 10μL CVB3（MOI=10）感染細(xì)胞，同時加入 20μg/ mL LLMP，感染 1 小時棄上清，加入含 抗菌肽的 2%FBS DMEM 維持液培養(yǎng)8 小時 Western Blot 檢測病毒衣殼蛋白 VP1 的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LLMP 在原代心肌細(xì)胞中具有顯著抑制 CVB3 復(fù)制的作用（圖 1.1）。這與MP KO 小 鼠 的 體 內(nèi) 抗 病 毒 結(jié) 果 一 致 ， 提 示 cathelicidin 抗RAMP/LL37）具有抑制 CVB3 在心肌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的作用。

圖 1.2 實驗用的抗菌肽 cathelicidin 濃度對細(xì)胞無毒性Figure1.2 cathelicidin concentration is safe for HT116 cells3.3 cathelicidin 劑量依賴性地促進(jìn) CVB3 在腸道上皮細(xì)胞 HCT116 的復(fù)制為詳細(xì)研究抗菌肽 cathelicidin 體外對 CVB3 在腸道上皮細(xì)胞系 HCT116 中復(fù)制的影響，采用以下 4 種方法對 CVB3 產(chǎn)出、VP1 蛋白表達(dá)、RNA 復(fù)制和活病毒效價進(jìn)行了檢測。3.3.1 GFP-CVB3 感染 HCT116 試驗證實抗菌肽促進(jìn) CVB3 在腸上皮細(xì)胞的病毒產(chǎn)出取生長良好的 HCT116 細(xì)胞，用 10μL帶綠色熒光的 GFP-CVB3（MOI=10）感染細(xì)胞，同時分別加入 5、10 以及 20μg/ mL 的 LL37 和 CRAMP 抗菌肽以及20μg/ mL 陰性對照 sLL-37 與 sCARMP（與 LL-37 和 CRAMP 含有相同的氨基酸，其氨基酸排列順序為亂序）。CVB337℃感染 1 小時棄上清，洗三遍后加

GFP-CVB3感染HCT116細(xì)胞觀察熒光病毒的產(chǎn)出Figure1.3GenerationofGFP-CVB3afterinfectionofHCT116cellwithGFP-CVB3

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5 杜牧;川金絲猴源CVB3抗體ELISA檢測方法的建立及血清學(xué)調(diào)查[D];吉林大學(xué);2009年

6 蘇楠;不同亞群骨髓來源抑制性細(xì)胞（MDSCs）在CVB3病毒性心肌炎中的作用和機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2012年

7 高鵬;利用琥珀抑制技術(shù)制備CVB3疫苗的初步研究[D];安徽大學(xué);2016年

8 趙嵐;端粒酶及TERT在實驗性小鼠CVB3心肌炎的作用及黃芪甲甙干預(yù)研究[D];南華大學(xué);2007年

9 張慧;心肌細(xì)胞—巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳遞及其在CVB3感染誘導(dǎo)的病毒性心肌炎中的作用[D];蘇州大學(xué);2014年

10 孫躍女;CVB3對大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及骨橋蛋白表達(dá)的影響[D];中南大學(xué);2007年

本文編號：2789328