【摘要】：研究背景:隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展,由人類(lèi)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)產(chǎn)生的水體富營(yíng)養(yǎng)化及其所造成的水華暴發(fā)成為全球關(guān)注的重要環(huán)境問(wèn)題。水華暴發(fā)時(shí),大量繁殖的藻類(lèi)所產(chǎn)生的次生代謝物微囊藻毒素(microcystins,MCs)對(duì)水生生物和人類(lèi)具有健康威脅。在超過(guò)100種的MCs異構(gòu)體中,微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)是最為常見(jiàn)且毒性最強(qiáng)的一種,肝臟是其主要的靶器官。MC-LR可以引發(fā)一系列的肝毒性,包括誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死、凋亡、肝出血等。目前認(rèn)為,MC-LR的主要致毒機(jī)理是通過(guò)抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2 A,PP2 A)的活性從而產(chǎn)生一系列的細(xì)胞毒性作用。PP2A是細(xì)胞內(nèi)主要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶,參與了包括細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)調(diào)控在內(nèi)的多種細(xì)胞生命活動(dòng)。α4是PP2A 一個(gè)重要的調(diào)節(jié)蛋白,它能對(duì)PP2A進(jìn)行多種調(diào)節(jié),包括調(diào)節(jié)PP2A活性和促進(jìn)PP2A核心酶組裝。α4的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活。α4還對(duì)細(xì)胞骨架具有一定調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)MC-LR能夠在多種細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞骨架發(fā)生重構(gòu),這可能與其抑制PP2A活性有關(guān)。隨后,我們?cè)谌伺吣I293細(xì)胞(HEK293)內(nèi)觀察到低濃度MC-LR引發(fā)了 PP2A活性應(yīng)激性上調(diào),這一現(xiàn)象可能與α4和PP2A/C亞基結(jié)合的改變有關(guān),暗示α4參與了對(duì)MC-LR細(xì)胞毒性效應(yīng)的調(diào)節(jié)過(guò)程。將HEK293細(xì)胞內(nèi)α4蛋白過(guò)表達(dá)后,本實(shí)驗(yàn)室最近還觀察到MC-LR對(duì)細(xì)胞骨架的破壞作用消失了,提示在MC-LR毒性效應(yīng)下α4的過(guò)表達(dá)提高了 HEK293內(nèi)細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性,這引發(fā)了我們?nèi)绻谄渌?xì)胞系中過(guò)表達(dá)α4是否具有同樣效應(yīng)的思考。本實(shí)驗(yàn)將探究MC-LR處理α4過(guò)表達(dá)的人肝細(xì)胞系7702(HL7702)后產(chǎn)生的各種細(xì)胞效應(yīng),這有助于更好地闡明MC-LR毒性效應(yīng)下α4,PP2A和細(xì)胞骨架的關(guān)系。研究方法:利用lipofectamineTM2000將α4表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入HL7702內(nèi)24h后,再分別用不同濃度的MC-LR(0μM,1μM和10μM)處理24h�？蛰d質(zhì)粒作為空載對(duì)照組。應(yīng)用酶活性測(cè)定試劑盒、免疫印跡技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)對(duì)本實(shí)驗(yàn)條件下產(chǎn)生的各種細(xì)胞效應(yīng)和相關(guān)分子變化進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果:MC-LR染毒α4過(guò)表達(dá)的HL7702后:PP2A活性受到顯著抑制;PP2A亞基蛋白水平和PP2A/C亞基的翻譯后修飾水平受到影響,如PP2A/C亞基表達(dá)上調(diào),PP2A/C亞基Y307位點(diǎn)磷酸化水平升高,PP2A/C亞基L309位點(diǎn)甲基化水平降低;PP2A/C亞基和α4的結(jié)合以及PP2A/C亞基和PP2A/A亞基的結(jié)合均顯著下降;PP2A 活性受到抑制的同時(shí),p-ERK(T202/Y204),p-JNK(T183/Y185)和p-P38(T180/Y182)磷酸化水平顯著上升,表明三條MAPK通路同時(shí)被激活;細(xì)胞內(nèi)微絲,微管和中間纖維形態(tài)和分布沒(méi)有發(fā)生變化,細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,而骨架相關(guān)蛋白VASP(S157)和Ezrin(T567)磷酸化水平上調(diào),VASP(S239)磷酸化水平下調(diào)。研究結(jié)論:α4過(guò)表達(dá)后,MC-LR仍然抑制了 HL7702細(xì)胞的PP2A活性,其作用方式可能是改變PP2A/C亞基蛋白水平及其翻譯后修飾水平,改變PP2A/C亞基和α4的結(jié)合以及PP2A/C亞基和PP2A/A亞基的結(jié)合;與未過(guò)表達(dá)α4的HL7702細(xì)胞類(lèi)似,ERK1/2,P38和JNK三條通路依然被激活;α4的過(guò)表達(dá)在一定程度上拮抗了 MC-LR對(duì)骨架的破壞作用,與骨架相關(guān)蛋白VASP(S157),VASP(S239)和Ezrin(T567)的磷酸化水平改變有關(guān);α4過(guò)表達(dá)的HL7702細(xì)胞對(duì)MC-LR的響應(yīng)與α4過(guò)表達(dá)的HEK293中類(lèi)似,但機(jī)制有所不同。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R99
【圖文】：

學(xué)碩士學(xué)位論文邐實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑邋ＭＣ－ＬＲ處理ａ４過(guò)表達(dá)的ＨＬ７７０２細(xì)胞后ＰＰ２Ａ亞基蛋白水平及翻譯后修飾的逡逑應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基和ＰＰ２Ａ／Ａ亞基的表達(dá)情況。結(jié)果如圖４．２．２，ｃｘ４過(guò)表達(dá)后，隨著染毒濃度的增大，ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基的表達(dá)逐漸升高，在最高逡逑濃度Ｐ１０組中出現(xiàn)了顯著升高。ＰＰ２Ａ／Ａ亞基的表達(dá)水平在各組中都沒(méi)有發(fā)生逡逑改變。ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基上３０７位點(diǎn)酪氨酸（Ｙ３０７）的磷酸化水平以及３０９位點(diǎn)亮逡逑（Ｌ３０９）的甲基化水平也有一定改變，隨著ＭＣ－ＬＲ染毒濃度的增大，ｐ－ＰＰ２Ａ／Ｃ３０７）的磷酸化水平上升，在最高染毒濃度Ｐ１０組中出現(xiàn)了顯著升高，而逡逑Ｐ２Ａ／Ｃ邋（Ｌ３０９）的甲基化水平下降，在最高染毒濃度Ｐ１０組中出現(xiàn)了顯著下降。逡逑

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文邐實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑４．２．３邋ＭＣ－ＬＲ邋處理ａ４邋過(guò)表達(dá)的邋ＨＬ７７０２邋細(xì)胞后造成邋ＰＰ２Ａ／Ｃ邋和ｃｔ４，邋ＰＰ２Ａ／Ｃ邋和邋ＰＰ２Ａ／Ａ逡逑解離逡逑采用免疫共沉淀法，本研究檢測(cè)了細(xì)胞中ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基和ａ４以及ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基逡逑和ＰＰ２Ａ／Ａ亞基結(jié)合水平的變化。結(jié)果如圖４．２．３所示，ａ４過(guò)表達(dá)后，隨著ＭＣ－ＬＲ逡逑染毒濃度的升高，ａ４與ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基的結(jié)合降低，在最高染毒濃度Ｐ１０組中結(jié)合逡逑水平顯著降低。另一方面，ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基和ＰＰ２Ａ／Ａ亞基的結(jié)合也隨著ＭＣ－ＬＲ染逡逑毒濃度的升高而降低，在最高染毒濃度Ｐ］0組中結(jié)合水平顯著降低。逡逑

解離逡逑采用免疫共沉淀法，本研究檢測(cè)了細(xì)胞中ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基和ａ４以及ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基逡逑和ＰＰ２Ａ／Ａ亞基結(jié)合水平的變化。結(jié)果如圖４．２．３所示，ａ４過(guò)表達(dá)后，隨著ＭＣ－ＬＲ逡逑染毒濃度的升高，ａ４與ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基的結(jié)合降低，在最高染毒濃度Ｐ１０組中結(jié)合逡逑水平顯著降低。另一方面，ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基和ＰＰ２Ａ／Ａ亞基的結(jié)合也隨著ＭＣ－ＬＲ染逡逑毒濃度的升高而降低，在最高染毒濃度Ｐ］0組中結(jié)合水平顯著降低。逡逑Ｉｎｐｕｔ邐ＩｇＧ邐Ｖｅｃ邐Ｐ０邐ＰＩ邐Ｐ１０逡逑ａ４邐ｍｕＭｉｎｉ灥逡逑ＰＰ？Ａ／ｒ邐４Ｍｍｉｍ邐ｆｌＨＢＩ逡逑Ｊｒ邋－ｉ邋ｚ＾ｊｔ＼Ｊ邋ｖ＿邐邐邋邐－邐．邋１邐＇＊＇＇＇？逡逑ｐｐ遍邐————逡逑ｐｐ＊＾ａ／ｃ逡逑圖４．２．３邋ＭＣ－ＬＲ對(duì)ａ４過(guò)表徸的ＨＬ７７０２細(xì)胞內(nèi)ＰＰ２Ａ／Ｃ和ｃｔ４，邋ＰＰ２Ａ／Ｃ和ＰＰ２Ａ／Ａ結(jié)合的逡逑影響。＊，ｐ＜0．0５；邋＊＊，ｐ＜０．０１；邋＊＊＊，邋ｐ＜０．００１；邋ｎ＝３逡逑Ｆｉｇ．邋４．２．３邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ＭＣ－ＬＲ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｏｆ邋ＰＰ２Ａ／Ｃ邋ａｎｄ邋ａ４邋ａｓ邋ｗｅｌｌ邋ａｓ邋ＰＰ２Ａ／Ｃ邋ａｎｄ逡逑ＰＰ２Ａ／Ａ邋ｉｎ邋ａ４－ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ邋ＨＬ７７０２邋ｃｅｌｌｓ．邋＊，邋ｐ＜０．０５；邋＊＊，邋ｐ＜０．０１；邋＊＊＊，邋ｐ＜０．００１；邋ｎ＝３逡逑２０逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2788749