【摘要】：具有正確折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)在人體生命活動中發(fā)揮著重要的生理功能,但在一定條件下,蛋白質(zhì)分子可發(fā)生錯誤折疊,形成淀粉樣沉積,從而引發(fā)多種疾病,如帕金森綜合癥、亨廷頓氏舞蹈癥和阿爾茲海默癥等。在形成淀粉樣纖維的過程中,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋含量減少,β-折疊含量增加,分子內(nèi)部的疏水區(qū)域外露,分子間形成聚集體,進而組裝成為淀粉樣纖維。在此過程中,多種因素,諸如溫度、pH、離子強度、環(huán)境中的大分子,以及部分小分子化合物等都可對其產(chǎn)生作用,影響纖維的形成。研究表明,一些天然多酚類化合物可抑制蛋白質(zhì)淀粉樣纖維的形成,對成熟纖維具有解聚作用,或者誘導纖維轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型聚集體,從而降低纖維的細胞毒性。多酚化合物的抗纖維化作用的機制非常復雜,目前普遍認為,多酚化合物主要以其完整分子的形式與纖維作用,導致纖維的生長抑制或解聚,其易氧化的特性通常被忽視。本實驗室先前實驗結(jié)果表明,天然多酚的自氧化產(chǎn)物具有更強的抗纖維化作用。因此,進一步探索多酚化合物的自氧化性質(zhì)及其產(chǎn)物的抗纖維化作用,對新型藥物的設(shè)計及篩選具有重要意義。本研究對沒食子酸兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子酸和抗壞血酸在通常實驗條件下的自氧化進行了分析,評估了這些化合物的穩(wěn)定性,并采用牛胰島素和溶菌酶作為淀粉樣纖維化的模型蛋白,對比不同條件下形成的氧化產(chǎn)物對蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化的抑制作用,探索這些化合物及其氧化產(chǎn)物的抗淀粉樣纖維化作用的分子機制。實驗方法及研究結(jié)果1.牛胰島素和溶菌酶的淀粉樣纖維化行為在一定的實驗條件下,牛胰島素和溶菌酶可轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸蹣永w維。實驗采用硫磺素T(ThT)熒光標記法、圓二色譜法檢測淀粉樣纖維化過程中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化,8-苯胺基-1-苯磺酸鈉(ANS)檢測纖維化過程中蛋白質(zhì)疏水區(qū)域的暴露程度,透射電子顯微鏡(TEM)對纖維化過程中形成的聚集體形貌進行表征。結(jié)果表明,牛胰島素和溶菌酶在形成淀粉樣纖維的過程中,其二級結(jié)構(gòu)中β-折疊的含量逐漸增多,逐漸暴露的疏水區(qū)域與熒光探針特異性結(jié)合,顯示出較高的熒光強度,同時,TEM可觀測到牛胰島素和溶菌酶形成的纖維結(jié)構(gòu)。2.EGCG及其氧化產(chǎn)物對蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化的作用具有多酚結(jié)構(gòu)的EGCG在通常的溶液條件下不穩(wěn)定,容易發(fā)生自氧化。本研究探索了 EGCG在pH 6.5～9.0條件下的穩(wěn)定性,并對其氧化產(chǎn)物EGCGox對牛胰島素和溶菌酶淀粉樣纖維化過程的影響進行了評估。實驗結(jié)果表明,EGCG對纖維化過程有一定的抑制作用,不同pH條件下形成的EGCGox對纖維化的抑制作用都強于EGCG,其中,在弱堿性條件下形成的氧化產(chǎn)物對纖維生長的抑制效果更強。在此基礎(chǔ)上,對pH 7.4條件下形成的氧化產(chǎn)物的抗纖維化作用進行了進一步的探究,結(jié)果表明,pH 7.4條件下形成的EGCGox具有較強的抑制纖維生長的作用,同時對成熟纖維也具有較好的降解作用。3.沒食子酸對淀粉樣纖維化的抑制作用對EGCG在pH 7.4條件下形成的氧化產(chǎn)物進行高效液相色譜和質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)經(jīng)氧化形成的EGCGox主要由相對分子量為170的小分子化合物組成,通過分析和推斷,確定該分子為另一種多酚化合物—沒食子酸。以溶菌酶作為模型蛋白,發(fā)現(xiàn)沒食子酸對溶菌酶纖維的生長具有抑制作用,同時能夠降解成熟的溶菌酶纖維。與EGCG一樣,沒食子酸的分子結(jié)構(gòu)也不穩(wěn)定,在pH 7.4條件下會再次發(fā)生氧化。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn),沒食子酸氧化產(chǎn)物的抗纖維化作用仍強于沒食子酸。4.抗壞血酸對蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化的抑制作用抗壞血酸(Ascorbic acid),又稱為維生素C(VetaminC;Vc),是一種重要的維生素和生物抗氧化劑。研究表明,Vc具有抑制蛋白質(zhì)纖維化的作用,并且蛋白質(zhì)淀粉樣沉積相關(guān)疾病通常伴隨著Vc的代謝異常。Vc在生理條件下的自氧化及其不穩(wěn)定性與其生物活性密切相關(guān)。所以,分析Vc的自氧化行為,探索Vc自氧化產(chǎn)物的抗淀粉樣纖維化作用具有重要意義。本研究以溶菌酶和牛胰島素為模型蛋白,探索了 Vc的自氧化動力學,檢測了 Vc及其主要自氧化產(chǎn)物脫氫抗壞血酸和赤蘚酮糖的抗淀粉樣纖維化作用。結(jié)果表明,Vc在酸性和弱堿性條件下都不穩(wěn)定,易發(fā)生自氧化。Vc及其自氧化產(chǎn)物均可抑制溶菌酶淀粉樣纖維化和降解成熟的淀粉樣纖維,其抗纖維化作用與Vc的氧化程度呈正相關(guān),即Vc的氧化程度越高,產(chǎn)物的抗纖維化作用越強。因此,Vc的自氧化產(chǎn)物可能是其抗纖維化作用的主要活性形式。結(jié)論:多酚類化合物EGCG、沒食子酸,以及抗氧化劑Vc對蛋白淀粉樣纖維化具有一定的抑制作用,本文對這些化合物在不同pH條件下的穩(wěn)定性及其氧化產(chǎn)物的抗纖維化作用進行了研究。結(jié)果表明,EGCG在弱堿性條件下易發(fā)生氧化,所有pH條件下形成的EGCGox都具有比EGCG更強的抗纖維化作用,在pH 7.4條件下形成的EGCGox對蛋白纖維化具有更好的抑制效果。沒食子酸作為EGCG的一種主要氧化產(chǎn)物,同樣對淀粉樣纖維化具有抑制作用,但其化學結(jié)構(gòu)仍不穩(wěn)定,產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物對纖維化的抑制作用仍強于沒食子酸。維生素C在通常實驗條件下易發(fā)生自氧化,生成多種氧化產(chǎn)物,通過對比實驗發(fā)現(xiàn),Vc的氧化產(chǎn)物脫氫抗壞血酸和赤蘚酮糖具有比Vc更強的抗淀粉樣纖維化作用。上述結(jié)果揭示了幾種常見的天然還原劑的抗淀粉樣纖維化作用與其自氧化性質(zhì)有關(guān),進一步對這些氧化產(chǎn)物進行分離和篩選,可以尋找出具有更強作用的蛋白淀粉樣纖維化抑制劑,為研發(fā)神經(jīng)退行性疾病的治療藥物提供了新的選擇。
【學位授予單位】：陜西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R96
【圖文】：

白進行了氨基酸測序，發(fā)現(xiàn)不同物種胰島素的一級結(jié)構(gòu)基本相似。人胰島素與牛逡逑胰島素的不同點僅表現(xiàn)為Ａ鏈中第８位的丙氨酸被蘇氨酸代替，第１０位的纈氨酸逡逑被異亮氨酸代替，而Ｂ鏈中的第３０位丙氨酸被蘇氨酸代替（圖１－２）。胰島素分逡逑子中除了通過三個二硫鍵連接兩條肽鏈形成分子結(jié)構(gòu)外，同時還通過復雜的氫鍵逡逑作用使蛋白分子維持相對穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)［３２＿３４］。逡逑午膜Ｓ象逡逑人胰島素■邐撕逡逑牛胰島康逡逑圖１－２牛胰島素與人胰島素的一級結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ邋１－２．邋Ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｓｔｉ＊ｕｃｔｕｒｅ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｂｏｖｉｎｅ邋ｉｎｓｕｌｉｎ邋ａｎｄ邋ｈｕｍａｎ邋ｉｎｓｕｌｉｎ．逡逑由于生物體中的胰島素結(jié)構(gòu)基本相似，分子結(jié)構(gòu)相對比較簡單，并且具有特逡逑定的空間結(jié)構(gòu)。在特定條件下，牛胰島素能夠在體外條件下形成淀粉樣蛋白，因逡逑此非常有利于蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)的探宄。結(jié)果表明，牛胰島素在ＰＨ２，邋６５邋°Ｃ的條件逡逑下能夠形成淀粉樣纖維。逡逑１．４溶菌酶逡逑４逡逑

三級結(jié)構(gòu)是則在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上通過盤繞形成緊密的橢球型結(jié)構(gòu)，其三級結(jié)構(gòu)逡逑中含有三個ａ－螺旋結(jié)構(gòu)，同時還有部分肽鏈經(jīng)過反折疊形成反平行式的Ｐ－折疊結(jié)構(gòu)逡逑［３９］（圖１－３）。而據(jù)文獻報道，溶菌酶表面形成的裂隙，貝�。适侨芫傅幕钚灾行模义厦傅拇呋钚詣t是由蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)決定的［４０］。逡逑＆ｉｒｒｖ；）逡逑Ｉ邋￥}擦願犲義賢跡保橙芫傅慕峁雇跡ǎ粒督峁�；（n┤督峁瑰義希疲椋玨澹保常澹裕瑁邋澹穡潁椋恚幔潁澹幔睿溴澹常膩澹螅簦潁酰悖簦酰潁邋澹錚駑澹瑁澹鑠澹澹紓玨澹鰨瑁椋簦邋澹歟螅錚恚澹義先芫岡諤囟ǖ奶跫攏梢栽諤逋廡緯傻矸堊鞍�。栽r疚鬧�，晤U峭ü義隙約Φ扒迦芫岡謁嶁蘊跫碌娜卻砝唇械矸堊酆稀＝峁礱鰨呶潞偷灣義希穡忍跫薊岬賈碼牧炊狹押碗畝蔚男緯�，在Ｐ｝x玻澹叮靛

本文編號：2788748