【摘要】：腦膠質(zhì)瘤具有生長迅速,復(fù)發(fā)率高和侵襲性強(qiáng)等特性,是目前死亡率最高的幾類腫瘤之一�；瘜W(xué)藥物治療是最常用的腦膠質(zhì)瘤治療手段,但是由于血腦屏障(BBB)的存在,大多數(shù)化療藥物難以穿透BBB遞送進(jìn)入大腦,并且藥物對于腫瘤細(xì)胞不具有選擇性,限制了化療藥物對腦膠質(zhì)瘤的療效。藥物遞送系統(tǒng)是解決以上問題的策略之一,其中又以具有低免疫原性、低毒性、生物可降解、高生物相容性等優(yōu)點(diǎn)的脂質(zhì)體最為適宜,脂質(zhì)體表面含有豐富的官能團(tuán),能夠?qū)ζ涓男�、修飾后使其達(dá)到更優(yōu)的性質(zhì),如主動靶向腫瘤細(xì)胞以及通過部分之前不能通過的生物屏障等。八聚精氨酸(R8)是一種典型的細(xì)胞穿膜肽(Cell-penetrating peptide,CPPs),具有較強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透能力和較強(qiáng)的陽離子特性,能夠與細(xì)胞表面的負(fù)電殘基形成氫鍵,在細(xì)胞膜電勢作用下穿過細(xì)胞膜。而且R8富含氨基,可以通過酰胺鍵與疏水基團(tuán)(如脂肪酸、油酸等)連接進(jìn)行修飾。轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)是一種糖蛋白,Tf作為腦靶向配體與TfRs具有較強(qiáng)的親和力,Tf修飾賦予脂質(zhì)體腦腫瘤靶向能力,遞送化療藥物進(jìn)入腦內(nèi)達(dá)到靶向治療腦膠質(zhì)瘤的目的�；谝陨涎芯勘尘�,本文以化療藥物阿霉素(DOX)為模型藥物,構(gòu)建CPPs和Tf共修飾DOX脂質(zhì)體,賦予其穿過BBB、腫瘤細(xì)胞雙主動靶向及高效穿膜功能,首先,利用脂質(zhì)體表面的Tf介導(dǎo)脂質(zhì)體主動靶向BBB,當(dāng)脂質(zhì)體與BBB足夠接近的情況下在CPPs的作用下,脂質(zhì)體高效穿過BBB,然后,在腦內(nèi)Tf介導(dǎo)脂質(zhì)體主動靶向腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞,同樣,CPPs可以介導(dǎo)脂質(zhì)體穿過腫瘤細(xì)胞膜,最終,將DOX送達(dá)腫瘤細(xì)胞質(zhì)。本文具體圍繞DOX分析方法學(xué)的建立、CPPs修飾脂質(zhì)體的處方篩選及工藝優(yōu)化、性質(zhì)表征、CPPs和Tf共修飾脂質(zhì)體的制備及抗腦膠質(zhì)瘤活性研究等方面展開研究。具體研究結(jié)果如下:1.DOX分析方法學(xué)的建立:為了對DOX含量進(jìn)行定量分析,本章建立了DOX體內(nèi)外分析方法學(xué),并對方法學(xué)的各項(xiàng)性質(zhì)進(jìn)行考察。首先,使用高效液相色譜(HPLC)對DOX分析方法的精密度、回收率、穩(wěn)定性進(jìn)行研究,建立體外分析方法學(xué)。然后,建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC/MS/MS)檢測腦組織中DOX含量的體內(nèi)分析方法學(xué),并對方法的準(zhǔn)確度、精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性進(jìn)行評價。結(jié)果顯示,HPLC方法可以在體外準(zhǔn)確、精密分析脂質(zhì)體中DOX的含量,方法學(xué)滿足DOX體外定量分析要求;UPLC/MS/MS分析方法可以準(zhǔn)確、精密定量分析腦組織中DOX的含量,分析方法可以排除腦組織中生物基質(zhì)對DOX檢測的干擾。UPLC/MS/MS分析方法學(xué)滿足DOX體內(nèi)定量分析的要求。2.OA-R8脂質(zhì)體遞送DOX系統(tǒng)的建立:本章對CPPs修飾脂質(zhì)體的處方和工藝進(jìn)行優(yōu)化,以其得到理化性質(zhì)最優(yōu)的脂質(zhì)體進(jìn)行下一步修飾。使用乙醇注入法結(jié)合硫酸銨梯度法主動載藥制備CPPs修飾的DOX脂質(zhì)體(R8PLP),以粒徑、包封率等作為評價指標(biāo)對R8PLP中陽離子磷脂/OA-R8/ePC/膽固醇/DSPE-PEG2000之間的比例、陽離子磷脂種類、硫酸銨濃度及脂相/硫酸銨溶液的體積比等因素進(jìn)行優(yōu)化。制備R8PLP的最佳條件為DOTAP作為陽離子磷脂,DOTAP/OA-R8/ePC/Chol/DSPE-PEG=20/25/18/32/3,脂相/水相=1/10,硫酸銨濃度為250μM,攪拌速度為300 rpm,注入速度為5.5 mL/min制備R8PLP;DOX主動載藥條件:選用藥脂比為1/10,在pH值為7.4、溫度45℃的條件下載藥時間30 min,完成R8PLP的載藥。3.OA-R8脂質(zhì)體遞送DOX系統(tǒng)的評價:本章主要對前文制備的R8PLP的體內(nèi)外性質(zhì)進(jìn)行表征。首先,制備了用于腦部遞送DOX的R8PLP,然后,對R8PLP的理化性質(zhì)進(jìn)行表征,體外抗腫瘤活性、細(xì)胞攝取進(jìn)行相應(yīng)評價。制備的R8PLP呈球形,表面光滑,分散性好,粒徑均一,粒徑大約為100 nm;R8PLP的ζ電位為14.71 mV;R8PLP在37℃和4℃條件下,在10.0%血清、PBS和去離子水中,48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好;凍干后的R8PLP在37℃和4℃條件下,在10.0%血清、PBS和去離子水中,48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。DOX、LP、PLP、R8LP、R8PL對U87和GL261細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤活性,并且抗腫瘤活性具有時間依賴性;給藥24 h后,R8LP、R8PL活性顯著高于DOX、LP、PLP,推測OA-R8修飾可以提高DOX對U87和GL261細(xì)胞的抗腫瘤活性。最后,對R8PLP的BBB通過能力進(jìn)行評價:與PLP相比,R8PLP在腦組織內(nèi)蓄積效果顯著,R8PLP中DOX在腦內(nèi)的藥時曲線下面積(AUC0.5-12h)為PLP的2.4倍。然而,R8PLP的半衰期(t_(1/2))與PLP相似(3.47 vs 3.94 h),這些結(jié)果表明,OA-R8修飾的脂質(zhì)體具有更好的BBB穿透性和腦組織蓄積能力。4.Tf和OA-R8共修飾脂質(zhì)體遞送DOX系統(tǒng)的建立及評價:本章在R8PLP的基礎(chǔ)上,討論了Tf含量對脂質(zhì)體靶向性與抗腫瘤效果的影響,建立了Tf和OA-R8共修飾脂質(zhì)體遞送DOX系統(tǒng)(Tf-R8PLP),并對其粒徑、血清中的穩(wěn)定性、包封率和藥物體外釋放性能進(jìn)行評價。除此之外,分析了Tf-R8PLP的體外細(xì)胞攝取。建立了裸鼠膠質(zhì)瘤模型,并評估了Tf-R8PLP的體內(nèi)抗腫瘤功效。對Tf-R8PLP治療后,藥物在裸鼠體內(nèi)的組織分布和裸鼠器官(包括腦、心、臟、肝、脾、肺和腎)的病理學(xué)進(jìn)行評價。Tf-R8PLP的最佳制備條件為R8PLP/Tf-PEG-DSPE的摩爾比例為1/100;Tf-R8PLP的粒徑為128.64 nm,ξ-電位為6.81 mV,Tf的濃度為16.15μg/mL;Tf-R8PLP具有球形結(jié)構(gòu),粒徑均一,Tf-R8PLP在血清中的穩(wěn)定性良好;Tf-R8PLP均呈現(xiàn)了控制釋放行為;Tf-R8PLP具有最高的腫瘤生長抑制率,Tf-R8PLP的體內(nèi)抗腫瘤活性顯著高于R8PLP和DOX;Tf-R8PLP組的小鼠生存時間(25天)均比生理鹽水組(20天)、DOX組(22天)和R8PLP組(24天)長,Tf-R8PLP對于腦膠質(zhì)瘤的治療具有顯著的效果。綜上所述,本文制備了具有BBB、腫瘤細(xì)胞雙主動靶向及高效穿膜功能的DOX脂質(zhì)體,該脂質(zhì)體理化性質(zhì)優(yōu)異,在體內(nèi)外均有較好的抗腫瘤效果。為治療腦膠質(zhì)的多功能脂質(zhì)體的臨床應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R943;R96
【圖文】：

是一種前體藥，可以口服（pH<7.0） 1.8 h[29]。pH＞7.0 時，替莫唑胺會分解唑-4-羧胺），簡稱 MITC。它能夠使種堿基烷基化所引起的無效錯配修復(fù) DNA 單鏈斷裂，DNA 雙鏈斷裂，最終過程如圖 1.1 所示[19]。現(xiàn)在有很多科學(xué)究，華中科技大學(xué)的解圓圓在“載替莫瘤的作用”等方面進(jìn)行了相關(guān)研究[30]，2/M 期，抑制細(xì)胞增殖，對 C6 細(xì)胞的果[30]。雖然替莫唑胺在腦膠質(zhì)瘤治療膠質(zhì)瘤患者帶來希望，但是替莫唑胺存而且替莫唑胺在甲醇中極微溶，在乙醇唑胺注射液的臨床應(yīng)用帶來了較大的

DOX 是一種廣譜抗腫瘤活性的蒽環(huán)類抗生素，由鏈霉菌產(chǎn)生，具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用[17, 18]，是目前應(yīng)用最廣泛的抗癌藥物之一，對核酸具有很高的親和性，能插入核酸鏈的堿基對之間，抑制 DNA 的合成，從而抑制腫瘤的增長[33,34]。DOX 水溶性好，在使用過程中，不需要添加像聚氧乙烯蓖麻油或 Tween 80等助溶劑，因此，DOX 被廣泛用于腦膠質(zhì)瘤的治療。Chen 等[35]使用 DOX 作為化學(xué)藥物治療腦膠質(zhì)瘤，結(jié)果如圖 1.2 所示。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DOX 的濃度為 100 ng/mL 時，DOX 對 C6 細(xì)胞的抑制率為~60.0%，但是，小鼠平均生存天數(shù)為 19 天，僅高于空白組 2 天（17 天），而且，DOX 組小鼠的體重明顯降低。Zong 等[8]也選用 DOX 作為抗腦膠質(zhì)瘤藥物用于腦膠質(zhì)瘤的治療，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng) DOX 濃度為 3.125 μg/mL 時，C6 細(xì)胞的存活率為~50%，而且 C6 細(xì)胞對于 DOX 具有較強(qiáng)的攝取量。Gao 等[36]也使用 DOX 作為化學(xué)藥物治療腦膠質(zhì)瘤，出現(xiàn)了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖 1.3 cRGD-RCCM 的制備和治療腦膠質(zhì)瘤流程[50]Figure 1.3 cRGD-functionalized and reversibly core-crosslinked multifunctionalPEG-PCL micelles (cRGD-RCCMs) for highly potent and targeted gliomachemotherapy[50]除此之外，Singleton 等[51]也制備了納米膠束，負(fù)載帕比司他用來治療腦膠質(zhì)瘤。首先，在磁力攪拌下，將 P407 聚合物直接溶解到 CSF 中，制備 5%的 P407溶液，然后加入 0.5 mL 的 CHCl3，攪拌均勻后，將 CHCl3蒸發(fā)，最后，進(jìn)行藥物裝載。結(jié)果顯示，制備的膠束藥物遞送系統(tǒng)具有較好的抗腦膠質(zhì)瘤效果，生存時間延長至 60 天[51]。雖然，基于膠束的 DDS 在腦膠質(zhì)瘤治療方面具有較好的效果，但是在制備膠束的過程中，均使用了有機(jī)溶劑，而在制備過程中，有機(jī)溶劑難以完全除去，這將對人體構(gòu)成一定的傷害[49]。1.3.2 基于納米粒的 DDS

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