【摘要】：研究目的:微囊藻毒素是一種危害極大的單環(huán)七肽類化合物,是藍(lán)藻的某些屬類產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,在發(fā)生水華的水體中普遍存在。當(dāng)前日漸嚴(yán)重的水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致水華頻發(fā)以致大量微囊藻毒素產(chǎn)生并被釋放進(jìn)入水體。微囊藻毒素嚴(yán)重影響人類健康。目前很多研究表明,微囊藻毒素與人原發(fā)性肝癌、大腸癌的發(fā)生都有緊密的相關(guān)性。近期又有研究發(fā)現(xiàn)Microcystin-LR(MC-LR)可能是引起糖尿病的環(huán)境致病因素之一。在本實驗室的前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的MCLR染毒24 h能夠引起人肝細(xì)胞株HL7702及小鼠肝臟組織中胰島素信號通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平的改變。由于胰島素信號通路具有應(yīng)對胰島素刺激作出快速反應(yīng)的能力并有十分復(fù)雜的反饋機制,探討胰島素信號通路信號蛋白對微囊藻毒素作用的響應(yīng)時間效應(yīng)顯得尤為重要。因此本研究的目的是研究在更短的染毒時間條件下不同濃度MCLR對肝臟胰島素信號通路相關(guān)蛋白的影響以及作用的特點,該研究有助于我們今后對微囊藻毒素與代謝疾病的關(guān)系更加完整的認(rèn)識。研究內(nèi)容:(一)細(xì)胞實驗:以人肝細(xì)胞株HL7702為材料,探討不同濃度MCLR在不同染毒時間(30min、1h、6 h)下對蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性以及胰島素信號通路關(guān)鍵信號分子,包括Akt、GSK3α、GSK3β及其下游底物糖原合酶(GS)的影響;(二)動物實驗。以ICR雄性小鼠為材料,研究在腹腔注射不同濃度MCLR 1小時后MCLR在肝、胰組織中的積累,MCLR對肝、胰腺的病理學(xué)影響,以及對肝臟PP2A及肝臟胰島素信號通路關(guān)鍵分子,包括IRS1、Akt、GSK3α、GSK3β及底物GS的影響,并對其中一些指標(biāo)同時采取western blot和免疫組化方法檢測以互相驗證。通過細(xì)胞實驗與動物實驗結(jié)果的比較分析來探討短時間染毒條件下MCLR對肝臟胰島素信號通路的影響及通過結(jié)合前期的24 h實驗結(jié)果來進(jìn)一步分析可能的作用模式。研究方法:應(yīng)用免疫印跡技術(shù)、細(xì)胞酶活力檢測研究不同濃度MCLR(0μM、1 μM、5 μM、10 μM)對人肝細(xì)胞系HL7702中胰島素信號通路關(guān)鍵信號分子的影響,應(yīng)用免疫印跡技術(shù)、細(xì)胞酶活力檢測、免疫組化、HE組織染色技術(shù)研究不同濃度MCLR(0 μg/kg、40 μg/kg、80 μg/kg、120 μg/kg)對小鼠肝臟組織中胰島素信號通路關(guān)鍵信號分子的影響。研究結(jié)果:(一)MCLR處理HL7702細(xì)胞30 min、1h、6h后均造成PP2A活性的抑制,抑制率呈現(xiàn)染毒濃度及染毒時間依賴性。(二)在HL7702細(xì)胞中,MCLR處理細(xì)胞30min、1h、6h均引起Akt的磷酸化上升,影響了GSK3和GS的磷酸化水平。(三)給ICR雄性小鼠腹腔注射不同濃度的MCLR后發(fā)現(xiàn),染毒1 h的小鼠活動無明顯異常,染毒2h,高劑量組(120 μg/kg MCLR)小鼠開始出現(xiàn)死亡,染毒5h后最高及次高劑量組(80、120 μg/kg MCLR)的小鼠全部死亡。(四)對小鼠肝臟進(jìn)行HE染色觀察發(fā)現(xiàn),高劑量組的小鼠肝臟相比對照組有明顯的肝細(xì)胞變性(濁腫)以及肝出血,但沒有發(fā)現(xiàn)MCLR對于胰腺有明顯作用。(五)給ICR雄性小鼠腹腔注射MCLR 1 h后測定其肝臟PP2A活性,發(fā)現(xiàn)PP2A的酶活性呈現(xiàn)濃度依賴性下降,Akt的Ser473以及Thr308位點的磷酸化水平均呈現(xiàn)濃度依賴性升高,GSK3α以及GSK3β的磷酸化水平和GS及其磷酸化在MCLR刺激下有升高趨勢,其中AKT的Ser473位點的磷酸化、GSK3β的磷酸化以及GS蛋白水平升高的結(jié)果在免疫組化中得到良好驗證。(六)腹腔注射ICR雄性小鼠1h取其肝臟,肝組織內(nèi)IRS1的Ser磷酸化水平顯著升高,IRS1總蛋白水平下降。研究結(jié)論:(一)在短時間染毒條件下,MCLR抑制人肝細(xì)胞系HL7702中PP2A活性,且酶活性抑制率與染毒時間和染毒濃度呈正相關(guān)關(guān)系。(二)在短時間染毒條件下小鼠肝細(xì)胞中Akt磷酸化水平受MCLR作用后變化明顯,表明其極短時間里就會受到MCLR的影響,這也為檢測MCLR對肝臟胰島素通路的早期影響提供了 一個敏感指標(biāo)。(三)短時間染毒,MCLR將通過影響IRS1、Akt、GSK3α、GSK3β、GS的磷酸化水平而對肝細(xì)胞胰島素信號通路產(chǎn)生干擾。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R99
【圖文】：

基于本實驗室的前期研究結(jié)果，本研究選�。卞澹穑�、５ｐＭ、１０ｐＭ的ＭＣＬＲ胞染毒濃度，在此濃度下ＭＣＬＲ對細(xì)胞活力以及細(xì)胞周期沒有產(chǎn)生明顯影響１４６期研究發(fā)現(xiàn)２４邋ｈ染毒ＭＣＬＲ對胰島素信號通路的信號蛋白有影響＃１，本研究染毒時間３０ｍｉｎ、１邋ｈ和６ｈ，檢測ＭＣＬＲ對ＰＰ２Ａ活性、胰島素信號通路中要信號蛋白Ａｋｔ、ＧＳＫ３、及底物ＧＳ總蛋白及磷酸化蛋白的影響。逡逑．１邐ＭＣＬＲ對ＨＬ７７０２細(xì)胞中ＰＰ２Ａ活性影響逡逑如圖４．１．１所示，染毒３０邋ｍｉｎ后ＭＣＬＲ就對細(xì)胞內(nèi)ＰＰ２Ａ活性有了明顯的作用。在三種染毒時間中，ＭＣＬＲ均能夠引起ＰＰ２Ａ酶活力的下降，隨著染毒的延長，ＭＣＬＲ對ＰＰ２Ａ的抑制率也增加。染毒６邋ｈ時，ＭＣＬＲ對ＰＰ２Ａ活性制率與本實驗室之前研究中２４邋ｈ染毒的抑制率相似，半抑制濃度ＩＣ５０約在５逡逑ｌＯｐＭ之間丨４７１。逡逑－

４．１．２ＭＣＬＲ對ＨＬ７７０２細(xì)胞內(nèi)Ａｋｔ總蛋白水平及其磷酸化的影響。用ＭＣＬＲＨＬ７７０２細(xì)胞如圖所示濃度和時間后，用免疫印跡法檢測Ａｋｔ、ｐ－Ａｋｔ邋（Ｔｈｒ３０８及ｐ－Ａｋｔ邋（Ｓｅｒ４７３）水平，對免疫印跡法檢測結(jié)果進(jìn)行灰度分析后用獨立樣本ｔ驗進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，＊，邋ｐ＜０．０５；邋＊＊，ｐ＜０．０１，邋＊＊＊，ｐ＜０．００１；邋ｎ＝３。逡逑ｉｇ．邋４．１．２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＭＣＬＲ邋ｏｎ邋Ａｋｔ，邋ｐ－Ａｋｔ邋（Ｔｈｒ３０８）邋ａｎｄ邋ｐ－Ａｋｔ邋（Ｓｅｒ４７３）邋ｉｎ邋ＨＬ７７０２Ｌ７７０２邋ｗｅｒｅ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＭＣＬＲ邋ｆｏｒ邋３０邋ｍｉｎ，邋１邋ｈ邋ａｎｄ邋６邋ｈｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ邋ｂｅｆｏｒｅ邋Ａｋｔ，邋ｐ－Ａｋｔ邋（Ｔｈｒ３０８）邋ａｎｄ邋ｐ－Ａｋｔ邋（Ｓｅｒ４７３）邋ｗｅｒｅ邋ｅｘａｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｗｅｓｔｅｒｎｌｏｔ．邋Ｔｈｅ邋ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ邋ｗａｓ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ｔｏ邋ｏｂｔａｉｎ邋ｈｉｓｔｏｇｒａｍ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｓ邋ｗｅｒｅｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓａｍｐｌｅ邋ｔ－ｔｅｓｔ，邋＊，邋ｐ＜０．０５；邋＊＊，邋ｐ＜０．０１；邋ｎ＝３．逡逑．１．３邋ＭＣＬＲ對ＨＬ７７０２細(xì)胞中ＧＳＫ３的影響逡逑ＧＳＫ３是Ａｋｔ的底物之一，Ａｋｔ磷酸化ＧＳＫ３而抑制其激酶活性ｌ４９］。我們前ＭＣＬＲ染毒２４ｈ實驗中ｐ－ＧＳＫ３ａ、Ｐ－ＧＳＫ３Ｐ都是明顯升高的。本研究中，免跡結(jié)果（圖４．１．３）顯示，不同濃度ＭＣＬＲ處理ＨＬ７７０２邋不同時間后，細(xì)胞內(nèi)ＧＳＫ３以及0３艮３０總蛋白含量無明顯

圖４．１．３邋ＭＣＬＲ對ＨＬ７７０２細(xì)胞內(nèi)ＧＳＫ３ｃｔ、ＧＳＫ３Ｐ及它們的磷酸化的影響。所示濃度和時間ＭＣＬＲ處理ＨＬ７７０２細(xì)胞后，免疫印跡法檢測ＧＳＫ３ｏｕ邋Ｇｐ－ＧＳＫ３ａ以及Ｐ－ＧＳＫ３Ｐ水平，對免疫印跡法檢測結(jié)果進(jìn)行灰度分析后用獨ｔ邋檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；ｎ＝３0逡逑Ｆｉｇ．邋４．１．３邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＭＣＬＲ邋ｏｎ邋ＧＳＫ３ａ，邋ＧＳＫ３ｐ，邋ｐ－ＧＳＫ３ａ邋ａｎｄ邋ｐ－ＧＳＫ３ｐ邋ｉｎ邋ＨＨＬ７７０２邋ｗｅｒｅ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＭＣＬＲ邋ｆｏｒ邋３０邋ｍｉｎ，邋１邋ｈ邋ａｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ＧＳＫ３ａ，邋ＧＳＫ３Ｐ，邋ｐ－ＧＳＫ３ａ邋ａｎｄ邋ｐ－ＧＳＫ３ｐ邋ｗｅｒｅ邋ｅｘａｍｉｎｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ．邋Ｔｈｅ邋ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ邋ｗａｓ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ｔｏ邋ｏｂｔａｉｎ邋ｈｉｓｔｏｇｒａｍ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｗｅｒｅ邋ａｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓａｍｐｌｅ邋ｔ－ｔｅｓｔ，邋＊，邋ｐ＜０．０５；邋＊＊，邋ｐ＜０．０１；邋ｎ＝３．逡逑４．１．４邋ＭＣＬＲ對ＨＬ７７０２細(xì)胞中ＧＳ的影響逡逑胰島素信號通路中，ＧＳＫ３可以催化其底物ＧＳ磷酸化而抑制其糖原合性［５（）１。免疫印跡結(jié)果（圖４．１．４）顯示，不同濃度ＭＣＬＲ處理ＨＬ７７０２不同時細(xì)胞內(nèi)ＧＳ總蛋白含量均無明顯影響，而ｐ－ＧＳ呈現(xiàn)濃度依賴性升高趨勢，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明在染毒６ｈ之內(nèi)，ＧＳ的活性狀態(tài)基本沒有特別明

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8 姜

本文編號：2786257