【摘要】：盡管組合化學(xué)、超高通量篩選、后基因組計劃、計算機技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用等多種技術(shù)快速發(fā)展,在藥物研發(fā)的過程中仍然存在兩個瓶頸,一是靶標(biāo)生物大分子的確定和驗證;二是具有生物活性小分子的設(shè)計和發(fā)現(xiàn)。本文主要關(guān)注第一方面,即其中的靶標(biāo)分析方面。1.整合細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)的構(gòu)建及在VEGFR-2受體抑制劑靶標(biāo)鑒定上的應(yīng)用細(xì)胞膜色譜技術(shù)(cell membrane chromatography,CMC)是一種生物膜技術(shù)和色譜技術(shù)結(jié)合的分析方法,在一定程度上保留了細(xì)胞膜的生物學(xué)特征,可以模擬生理狀態(tài)下生物活性小分子與其細(xì)胞膜上靶蛋白相互結(jié)合的過程。整合細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)由多種細(xì)胞膜色譜模型、高效液相色譜、飛行時間質(zhì)譜整合而成,其中,多種細(xì)胞膜色譜模型既相互補充,又相互驗證,彌補了生物膜生命周期短、重現(xiàn)性差的內(nèi)在缺點;高效液相色譜可以對復(fù)雜樣品進(jìn)行有效分離;飛行時間質(zhì)譜可以準(zhǔn)確鑒定其中每種組分,使得到的結(jié)論與常規(guī)的細(xì)胞膜色譜相比,更加真實、準(zhǔn)確、可信。本部分應(yīng)用SMMC-7721/CMC和HepG2/CMC兩種不同原發(fā)性肝癌的細(xì)胞膜色譜模型,構(gòu)建了整合細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng),并用于8個人工合成化合物的活性和靶點評價研究中,這8個喹唑啉類化合物是針對血管內(nèi)皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)進(jìn)行設(shè)計合成的。在使用整合細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)進(jìn)行靶標(biāo)驗證的同時,也采用經(jīng)典的激酶抑制方法測定了以上8個化合物對VEGFR-2的抑制率。結(jié)果表明,化合物在整合細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)中的保留行為與激酶抑制率高低排序一致,即上述兩種方法存在相關(guān)性。與分別測定每個待評價化合物樣品的傳統(tǒng)方法相比,整合細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)可以直接分析含有多種樣品的復(fù)雜體系,得到結(jié)論真實、可靠,同時,更加節(jié)約時間和成本,可成為藥物研究中的一種實用分析方法。2.TCP-matrine探針的合成及在matrine靶標(biāo)分析中的應(yīng)用整合細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)可以快速、有效地分析生物活性小分子與細(xì)胞膜蛋白質(zhì)間是否存在相互作用,然而自然生物膜上含有成百上千種活性蛋白,小分子藥物可能與多種受體存在協(xié)同結(jié)合,受到各種非特異結(jié)合因素的干擾,在沒有其他關(guān)于可能結(jié)合靶標(biāo)相關(guān)信息的線索下,很難鑒定、確證或排除某種膜蛋白作為潛在靶標(biāo)的可能性,因此,將整合細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)用于生物活性小分子結(jié)合靶標(biāo)的準(zhǔn)確鑒定和驗證中,尚有困難,仍然需要其他更加深入、精細(xì)、直接的靶點鑒定技術(shù)的支持和配合,如基于親和探針的靶點分析技術(shù)。三功能探針(tri-functional probe,TCP)是親和探針的一種,是一種同時具有配體基團、光反應(yīng)基團、標(biāo)簽基團三種功能基團的探針,是生物活性小分子靶標(biāo)鑒定的有效手段�？鄥A(matrine)是一種天然生物堿,被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤的活性,但其直接結(jié)合靶標(biāo)和相關(guān)分子作用機制尚不明確,這也是阻礙將苦參堿進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造、活性增強、藥物劑型改良等研究開發(fā),最終成為臨床一線治療藥物的眾多障礙之一。因此,尋找并鑒定到苦參堿的直接作用靶標(biāo),意義重大。TC P-matrine探針是一個同時具有matrine、4-苯甲酸疊氮基、生物素的親和探針,其中matrine作為配體基團,4-苯甲酸疊氮基作為光反應(yīng)基團,生物素作為標(biāo)簽基團,與鏈霉親和素構(gòu)成生物放大系統(tǒng),用于靶蛋白的純化分析。本部分將TCPmatrine親和探針用于matrine的靶點鑒定研究中,首次證明了膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2,ANXA2)是中藥苦參中的活性成分苦參堿(同時也是一個有前景的抗癌藥)的直接結(jié)合靶蛋白,通過抗體阻斷實驗和敲低表達(dá)實驗進(jìn)一步證實了ANXA2是苦參堿發(fā)揮抗遷移藥效的關(guān)鍵分子,苦參堿可以有效抑制ANXA2介導(dǎo)的纖溶酶原(plasminogen,PLG)向纖溶酶(plasmin,PN)的生物轉(zhuǎn)化,從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。3.TCP-MLN8237探針的合成及在MLN8237靶標(biāo)分析中的應(yīng)用MLN8237是極光激酶A(Aurora Kinase A,AKA)的小分子選擇性抑制劑,具有抑制細(xì)胞生長、發(fā)育,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞遷移、侵襲等多種活性,Ⅰ期臨床試驗也表明MLN8237在惡性腫瘤方面具有較好的治療作用,同時存在一定程度的不良反應(yīng),如惡心、嘔吐、發(fā)熱、貧血等,在理論上,MLN8237可能存在其他潛在靶蛋白。尋找并鑒定到小分子MLN8237的其他直接作用靶點,為闡明其作用機制,更全面地掌握該分子特性,最終實現(xiàn)其廣泛的臨床應(yīng)用,具有重要的意義。在明確MLN8237構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)上,對其羧基部分進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,首次合成了TCP-MLN8237探針,該探針含有MLN8237、4-苯甲酸疊氮基、生物素三種不同的功能基團,且探針與藥物分子本身在促進(jìn)細(xì)胞凋亡上沒有明顯差異。與對照探針(骨架相同但不含有配體基團MLN8237,只含有4-苯甲酸疊氮基、生物素基團的探針)處理組相比,經(jīng)紫外光照射、磁珠純化富集、凝膠電泳分離、銀離子染色等操作后,只分離得到一個差異蛋白條帶,經(jīng)多級蛋白質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定,該蛋白為AKA,即目前公認(rèn)的MLN8237的最強靶點,說明TCP-MLN8237探針是有效的,但由于探針為剛性結(jié)構(gòu),可能對配體基團與其靶蛋白間相互結(jié)合過程有影響,仍然存在一些的局限,具有優(yōu)化和改進(jìn)的空間。4.DNA-MLN8237探針的合成及在MLN8237靶標(biāo)分析中的應(yīng)用在TCP親和探針的基礎(chǔ)上,將賴氨酸的剛性骨架更新為寡核苷酸鏈的柔性骨架,稱為DNA親和探針,由結(jié)合探針(binding probe,BP)與捕獲探針(capture probe,CP)共同組成。本部分利用DNA親和探針標(biāo)記方法,合成了含有MLN8237的BP,含有4-苯甲酸疊氮基、熒光素的CP,經(jīng)過BP(MLN8237)與靶蛋白結(jié)合、CP(4-苯甲酸疊氮基)與靶蛋白光交聯(lián)、CP(熒光素)在聚丙烯酰胺電泳膠上成像的步驟,最終鑒定得到除AKA之外的7個潛在靶蛋白,在這些潛在靶蛋白分子中,對p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase,p38)和層粘連蛋白受體(laminin receptor,LAMR)進(jìn)行了生物學(xué)驗證,其中,MLN8237與p38親和力約為8μM,相關(guān)生物學(xué)功能效應(yīng)(促進(jìn)細(xì)胞凋亡)可能被AKA所掩蓋;MLN8237與LAMR親和力約為1.8μM,可以部分解釋其抗腫瘤遷移和侵襲的生物學(xué)功能,為更深入地理解MLN8237的藥效、毒性、副反應(yīng)提供有效信息,為全面評價MLN8237作為潛在臨床候選藥物提供進(jìn)一步證據(jù)。同時,也說明,利用DNA親和探針尋找小分子的靶點,是一種十分有效的分析方法。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R917
【圖文】：

整合細(xì)胞膜色譜分析平臺是基于Aglient 1200系列高效液相色譜系統(tǒng)，由AgilentMassHunter 工作站控制（Aglient科技有限公司，帕洛阿爾托，加利福尼亞州，美國）。流路系統(tǒng)見下圖2-1。SMMC-7721和HepG2細(xì)胞膜色譜柱分別位于一個MXP9960的二位十通閥（羅內(nèi)特帕克，加利福尼亞州，美國）。另一裝有兩個500μL的樣品環(huán)同時作 為 柱 切 換 裝 置 和 兩 維 色 譜 的 切 換 界 面 。 SMMC-7721/CMC 和 HepG2/CMC（10mm×2.0mm id，5μm）作為第一維，Chromolith Performance RP-18e硅膠整體柱（100mm×4.6mm id 5μm，默克，達(dá)姆施塔特，德國）作為第二維。第一維色譜的流動相為5mM醋酸銨，流速為0.2mL/min。第二維色譜的流動相為0.1%甲酸水（A相）和乙腈（B相）。系統(tǒng)洗脫的流速為3.5mL/min，分流進(jìn)樣后進(jìn)入TOF-MS系統(tǒng)的流速約為0.4mL/min。每隔2.5min，第一維色譜分析得到的色譜餾分存貯于定量環(huán)中，進(jìn)入第二維色譜分離。質(zhì)譜條件如下：正離子模式全掃描

90%-20%乙腈。2.2.10 整合 CMC-HPLC-TOF-MS 系統(tǒng)的應(yīng)用八個喹唑啉酮衍生物以VEGFR-2為靶標(biāo)設(shè)計合成，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2-2。這些化合物的活性考察是將八個化合物的混合樣品進(jìn)樣至整合CMC-HPLC-TOF-MS系統(tǒng)進(jìn)行分離、分析和鑒定。混合樣品溶液第一維色譜的流動相為5 mM醋酸銨，第二維分析的洗脫條件為：0-2.0 min，30%-45% 乙腈；2.0-4.5 min，45%-90%乙腈；4.5-5.0min，90%-30%乙腈。圖2-2：喹唑啉酮衍生物的結(jié)構(gòu)Figure 2-2: Structures of the synthetic quinazoline derivatives.

- 24 -標(biāo)分別位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核）作為陰性對照。將包含上述四種對照的樣品混合液進(jìn)樣至系統(tǒng)中進(jìn)行分析，其二維色譜圖見圖2-3，結(jié)果顯示，索拉菲尼和維拉帕米在SMMC-7721/CMC和HepG2/CMC色譜柱上有顯著保留，而地塞米松和四環(huán)素則基本沒有保留。上述結(jié)果表明SMMC-7721和HepG2/CMC/整體柱/TOF-MS系統(tǒng)可以識別結(jié)合膜受體的活性組分，因而可以用于VEGFR-2潛在抑制劑的活性評估。2.3.3 應(yīng)用整合 CMC-HPLC-TOF-MS 系統(tǒng)對潛在 VEGFR-2 抑制劑的活性評價針對VEGFR-2設(shè)計合成了八個喹唑啉類衍生物，將包含八種樣品的混合溶液進(jìn)樣至系統(tǒng)進(jìn)行分析，根據(jù)八種化合物在第一維CMC中保留時間的不同進(jìn)行活性高低的排序，根據(jù)不同的分子量在第二維TOF-MS中進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定（見表2-1）�；旌蠘悠返亩S色譜圖見圖2-3。從保留情況看，化合物S4和S8在SMMC-7721/CMC和HepG2/CMC上均有保留

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