發(fā)布時間：2020-08-08 07:37

【摘要】：目的:本研究通過構(gòu)建含肝細(xì)胞尿素代謝關(guān)鍵酶和幾種主要CYP基因核心啟動子和增強(qiáng)子區(qū)域共有的肝富集轉(zhuǎn)錄因子(LETF)或異源物核受體的慢病毒表達(dá)載體,篩選對肝細(xì)胞氨代謝(尿素循環(huán)通路)和藥物代謝均有重要影響的最優(yōu)LETF+異源物核受體組合,構(gòu)建能夠同時應(yīng)用于BAL和肝毒性藥物檢測的功能突出的肝細(xì)胞。方法:1、采用腺病毒策略,利用其瞬時表達(dá)的特性對幾種常見的LETFs(C/EBPβ、HNF3β、HNF4α、HNF1α、HNF6和PGC1α)進(jìn)行多重組合篩選,通過實時定量PCR檢測五種主要的尿素循環(huán)關(guān)鍵酶(Arg1、OTC、CPS1、ASS和ASL)mRNA表達(dá)水平,從而篩選出對五種尿素循環(huán)關(guān)鍵酶正向調(diào)控較優(yōu)的肝富集轉(zhuǎn)錄因子組合。2、在之前組合的基礎(chǔ)上,加入涉及對CYP酶合成進(jìn)行調(diào)控的異源物核受體(CAR和PXR),再次進(jìn)行多重組合篩選,通過實時定量PCR檢測五種尿素循環(huán)關(guān)鍵酶和五種細(xì)胞色素氧化酶P450(CYP1A1、CYP2B6、CYP29、CYP2D6和CYP3A4)mRNA的表達(dá)水平,同時采用WB對它們的蛋白合成水平,最終確定對尿素循環(huán)和藥物代謝均有顯著影響的LETFs+異源物核受體的最優(yōu)組合。3、利用慢病毒穩(wěn)定表達(dá)的特性,構(gòu)建過表達(dá)優(yōu)化組合LETFs和異源物核受體的肝細(xì)胞株。4、檢測肝源性尿素生成量,驗證優(yōu)化重組肝細(xì)胞株的尿素代謝功能,同時采用CYP酶試劑盒間接檢測重組肝細(xì)胞株的CYP功能,最終確定LETFs和異源物核受體的優(yōu)化組合對肝細(xì)胞功能的影響情況。結(jié)果:1、結(jié)合前期實驗小組對ARG1、CPS1、OTC三種關(guān)鍵酶啟動子的研究,結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)資料,獲得與轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)的肝富集轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ、HNF3β、HNF4α、HNF1α、HNF6和PGC1α和異源物核受體PXR和CAR,并將其分別構(gòu)建于腺病毒表達(dá)載體。2、將34種腺病毒組合分別瞬時轉(zhuǎn)染于HepG2細(xì)胞中,實時熒光定量檢測五種尿素關(guān)鍵酶mRNA的表達(dá)(結(jié)果以2~(-△△Ct)值表示)。結(jié)果顯示,在不同轉(zhuǎn)錄因子組合的共同作用下,五種尿素酶的表達(dá)情況都各有不同。綜合多方面考慮,初步篩選排除掉一些明顯不合適的組合后,再對剩余的組合各自的五種酶實際qPCR表達(dá)值進(jìn)行分析,綜合優(yōu)選出了三種合適的組合用于下一步的實驗,分別為“C/EBPβ+HNF3β+HNF4α”、“C/EBPβ+HNF3β+HNF1α”、“C/EBPβ+HNF4α+HNF6”。3、為充分考慮到CYP酶的表達(dá)情況,將上述三個轉(zhuǎn)錄因子腺病毒組合分別與核受體PXR和CAR進(jìn)行11種組合,分別再次轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,實時定量檢測五種尿素代謝酶和五種CYP酶(CYP1A1、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4)的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在不同轉(zhuǎn)錄因子組合的共同作用下,十種功能酶的表達(dá)情況都各有不同。為使結(jié)果獲得更直觀的效果,將所有2~(-△△Ct)結(jié)果以“1”、“1 2”、“2”分段并使用不同顏色進(jìn)行標(biāo)識,其顏色深淺與mRNA表達(dá)水平的高低成正比關(guān)系,綜合分析優(yōu)選出“C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR”與“C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR”兩種組合,并構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)兩種優(yōu)化組合的HepG2細(xì)胞和BEL-7404細(xì)胞。4、WB結(jié)果顯示,兩種不同組合的重組細(xì)胞都高表達(dá)ASL蛋白,而ASS蛋白卻呈低水平狀態(tài)。并且,在C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR組合的作用下Arg1、OTC和CPS1三種蛋白都呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。5、檢測了兩種重組細(xì)胞的尿素合成量,評估重組細(xì)胞對氨的代謝能力。隨著氨濃度的增加,兩種不同組合重組細(xì)胞的尿素生成量有不同程度的增加。并且,在氨濃度較低的情況下,C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR組合在提高肝細(xì)胞的尿素產(chǎn)量效果上明顯高于對照組和C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR組合。在高濃度氨的條件下,C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR重組肝細(xì)胞的尿素產(chǎn)量有一定程度的提高。然而,兩種不同組合肝細(xì)胞的在尿素代謝功能在一定程度上還遠(yuǎn)不及原代肝細(xì)胞。6、同時檢測兩種重組細(xì)胞五種不同CYP酶蛋白合成水平和功能。在兩種不同轉(zhuǎn)錄因子組合的作用下,CYP1A1、CYP2D6和CYP3A4蛋白表達(dá)水平明顯增高,而CYP2B6蛋白水平呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài),CYP2C9表達(dá)水平則未見明顯改變,這一效果在功能檢測得到進(jìn)一步驗證。結(jié)論:1、針對尿素循環(huán)和藥物代謝兩大功能進(jìn)行分析,在肝富集轉(zhuǎn)錄因子和異源物核受體的組合中,以C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR組合和C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR組合較為理想,在一定程度上,兩種組合都能明顯改善氨代謝和藥物代謝兩大功能。2、針對尿素代謝功能進(jìn)行分析,C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR組合優(yōu)于C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR組合。3、針對藥物代謝功能進(jìn)行分析,C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR組合和C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR組合彼此間未見明顯差異。4、綜合分析,在同時改善氨代謝和藥物代謝兩大功能方面C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR組合效果更優(yōu),有望為進(jìn)一步的多種實驗性應(yīng)用提供取用便捷的人源肝細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96
【圖文】：

CYP2C9、CYP2D6 和 CYP3A4）在重組 HepG2 細(xì)胞（R1/R2）和重組 BEL-7404（R1/R2）中的蛋白表達(dá)水平情況。NC 組設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)對照 1。（C）：5 種 CYP 活力水平情況。采用Lytic P450-Glo 試劑盒，化學(xué)發(fā)光儀檢測 CYP 活性水平，數(shù)值與 CYP 活性成正比，越高 ， 代 表 活 力 水 平 越 高 。 (*P<0.05 ， n=3) 。 ( 注 釋 ： R1 和 R2 分 別 代 表C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR 組和 C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR 組)。5 重組細(xì)胞活性水平檢測為檢測過表達(dá)優(yōu)化組合對細(xì)胞活性的影響，我們比較了兩種重組細(xì)胞在第1 天、第 3 天、第 5 天和第 7 天的細(xì)胞活力（圖 5）。結(jié)果顯示，兩種不同組合重組細(xì)胞活力在前 3 天呈上升狀態(tài)，而第 5 天之后呈現(xiàn)明顯下降的趨勢。相較于對照組細(xì)胞，雖然 C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR 重組細(xì)胞活力稍微降低，但是經(jīng)分析并無統(tǒng)計學(xué)意義。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;Ammonia metabolism capacity of HepG2 cells with high expression of human glutamine synthetase[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2008年06期

2 諸葛堅,葉森,余應(yīng)年;穩(wěn)定表達(dá)人細(xì)胞色素P4501A2的HepG2細(xì)胞的建立及其代謝效應(yīng)[J];浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2003年05期

本文編號：2785276