【摘要】：研究背景:G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)是細(xì)胞膜上的一種7次跨膜受體,能將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。GPCR參與生物體內(nèi)多種重要的生理過(guò)程,也是重要的藥物靶點(diǎn)。苦味受體(bitter taste receptors,TAS2Rs)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的一員,可以介導(dǎo)舌頭上味蕾細(xì)胞的苦味感知過(guò)程。最近有文獻(xiàn)報(bào)道TAS2Rs不僅在氣管、胃腸道、子宮、膀胱等器官表達(dá),而且具有其特定的生理功能。然而,TAS2Rs在心血管系統(tǒng)的生理和藥理學(xué)研究鮮有報(bào)道。目前,僅有文獻(xiàn)報(bào)道集中在:TAS2Rs在人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物的心臟表達(dá);TAS2Rs與心臟的代謝和營(yíng)養(yǎng)傳感(nutrient-sensing)相關(guān),并且介導(dǎo)G蛋白依賴(lài)的左心室壓和主動(dòng)脈壓的降低。因此,TAS2Rs在心臟左心室的表達(dá)、功能及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路亟待研究。研究目標(biāo):明確TAS2Rs在大鼠心臟左心室的mRNA表達(dá)水平;闡明TAS2Rs對(duì)大鼠心臟功能的影響及苦味化合物調(diào)節(jié)心肌收縮的機(jī)制。研究方法:利用qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠左心室心肌組織和心肌細(xì)胞中TAS2Rs亞型的mRNA表達(dá)水平;利用Langendorff離體心臟灌流實(shí)驗(yàn),從離體心臟水平研究苦味化合物(苯甲地那銨、奎寧和氯喹)對(duì)大鼠心臟功能的影響,檢測(cè)指標(biāo)為心率、心電圖(electrocardiogram,ECG)和左心室舒縮功能等;利用離體組織浴槽實(shí)驗(yàn)從左心室心肌組織水平,研究預(yù)先給予電刺激(electrical field stimulation,EFS,1 Hz-5 V)或腎上腺素刺激后,苦味化合物(苯甲地那銨、奎寧和氯喹)對(duì)大鼠心肌收縮功能的影響;鈣火花是鈣信號(hào)的基本單元,是心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum,SR)上鈣釋放通道自發(fā)開(kāi)放或由L-型Ca~(2+)離子通道開(kāi)放進(jìn)一步觸發(fā)引起的局部鈣釋放事件,是心肌興奮-收縮耦聯(lián)的基本單位。在以上功能性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用激光共聚焦實(shí)驗(yàn)研究三種苦味化合物對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣火花釋放頻率的影響,闡明苦味化合物通過(guò)激活TAS2Rs降低心肌收縮的機(jī)制。研究結(jié)果:大鼠左心室表達(dá)6種TAS2Rs亞型,分別為T(mén)AS2R108、TAS2R120、TAS2R121、TAS2R126、TAS2R135和TAS2R143。其中TAS2R120表達(dá)水平最高,TAS2R108表達(dá)水平最低。在大鼠離體心臟水平,苦味化合物苯甲地那銨(0.1-2μM)、奎寧(1-100μM)和氯喹(1-100μM)灌流后可顯著降低大鼠心率(P0.05)。苯甲地那銨和奎寧可顯著增加大鼠離體心電圖QRS波群的傳導(dǎo)時(shí)間(P0.05),表明TAS2Rs的激活可延長(zhǎng)心臟傳導(dǎo)時(shí)程。其中,三種苦味化合物均可增加左心室收縮期(systolic duration)和舒張期(diastolic duration)(P0.05)。苯甲地那銨和氯喹均可降低左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)(P0.05)�？鼘帉�(duì)+dp/dtmax和-dp/dtmax無(wú)顯著影響。氯喹顯著降低左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure,LVDP)(P0.05)。50μM的奎寧顯著增加LVDP,當(dāng)濃度達(dá)到100μM時(shí),LVDP迅速降低(P0.05)。苯甲地那銨對(duì)LVDP無(wú)顯著影響(P0.05)。在組織水平上,系列濃度的苯甲地那銨(10-200μM)、奎寧(10-300μM)和氯喹(10-200μM)可顯著減弱電刺激誘導(dǎo)的心肌收縮(P0.05)。結(jié)果表明,單一濃度(20μM、50μM、100μM、200μM)的苯甲地那銨和奎寧可完全抑制腎上腺素誘導(dǎo)的收縮,其中高濃度(100μM、200μM)的苯甲地那銨和奎寧抑制速度比低濃度(20μM、50μM)快且抑制徹底;500μM的氯喹對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)的收縮有迅速的抑制作用,隨后這種抑制作用在57.8±21.9 s后消失。這些結(jié)果表明TAS2Rs的激活可顯著降低EFS和腎上腺素誘導(dǎo)的心肌收縮。隨后,利用L-型鈣離子通道抑制劑硝苯地平(nifedipine)、雷尼丁受體(ryanodine receptors)抑制劑丁卡因(tetracaine)、β腎上腺素受體抑制劑普萘洛爾(propranolol)和無(wú)鈣緩沖液,探究苦味化合物降低EFS誘導(dǎo)大鼠心肌收縮的機(jī)制。結(jié)果表明,EFS增加心肌細(xì)胞表面L-型鈣離子通道的開(kāi)放頻率,引起細(xì)胞外的Ca~(2+)經(jīng)L-型鈣離子通道進(jìn)入心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞內(nèi)的Ca~(2+)濃度增加,引起更多的Ca~(2+)經(jīng)雷尼丁受體從SR上的鈣庫(kù)釋放出來(lái),也被稱(chēng)作鈣致鈣釋放(calcium-induced calcium release)。L-型鈣離子通道抑制劑硝苯地平可抑制82.3±3.2%電刺激誘導(dǎo)的心肌收縮,隨后加入的三種苦味化合物均可抑制余存的心肌收縮。三種苦味化合物可能降低Ca~(2+)從雷尼丁受體的釋放而降低心肌收縮力。關(guān)于苦味化合物是否通過(guò)激活TAS2Rs降低心肌收縮力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,苦味化合物奎寧的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑GABA可以延緩奎寧對(duì)心肌收縮的抑制作用(P0.05)�；谝陨瞎δ苄詫�(shí)驗(yàn),我們推測(cè)TAS2Rs通過(guò)降低心肌細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)的釋放,從而降低心肌收縮。利用Fluo 4-AM熒光探針測(cè)定苯甲地那銨、奎寧和氯喹對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣火花釋放活動(dòng)的影響。結(jié)果表明苦味化合物明顯降低鈣火花釋放的頻率(P0.05)。結(jié)論:本研究首次證明了TAS2Rs mRNA在大鼠左心室表達(dá),并揭示TAS2Rs的激活可以減慢心率和心臟的傳導(dǎo)功能;減弱EFS和腎上腺素誘導(dǎo)的心肌收縮。其機(jī)制可能為苦味化合物激活TAS2Rs,降低Ca~(2+)經(jīng)雷尼丁受體的釋放頻率,從而減弱心肌收縮。這項(xiàng)研究表明,TAS2Rs激動(dòng)劑可能是治療室性心動(dòng)過(guò)速和心衰的有效藥物。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R965
【圖文】：

RNA 在大鼠左心室心肌組織和心肌細(xì)胞表達(dá)（TAS2Rs 的 mRNAPDH；N = 6， N：動(dòng)物數(shù)量；采用 multi grouped t-test，*P <心肌組織 vs. 心肌細(xì)胞）。AS2Rs mRNA are expressed in rat left ventricle tissue and news (Data were presented as relative expression of TAS2R genes to thethe number of rats, asterisks indicate multi grouped t-test：*P ＜ 0.tissue vs. cardiomyocytes).的研究結(jié)果顯示，在新生大鼠的全心共表達(dá) 32 種 TAS、TAS2R126、TAS2R135、TAS2R120、TAS2R121 是表過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了潛在 TAS2Rs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重2、瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道 5（TRPM5）的表達(dá)[63]�；氖倚募〗M織和新分離的心肌細(xì)胞中 6 種 TAS2Rs 亞型 TAS2R120、TAS2R121、TAS2R126、TAS2R135、TA

圖 4.1 LVDP 原始記錄。（A）分析每次給藥前 5 min的記錄，LVDP 的變化以給藥后數(shù)據(jù)同對(duì)照（100%）的比值表示；（B）放大的 LVDP 原始記錄。Figure 4.1 Original recording of langendorff experiment. (A) The 5 min recordings prior to theaddi-tion of compounds at each concentration were analysed. The LVDP was normalized to thevalues under control conditions (taken as 100%). (B) The original recording in (A) shown in anenlarged time scale.4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果將苦味化合物苯甲地那銨、奎寧和氯喹分別加入灌流液中進(jìn)行離體心臟的灌流。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三種苦味化合物均可顯著減慢大鼠離體心臟的心率 (P ＜ 0.05)，且呈濃度依賴(lài)性。苯甲地那銨和奎寧可顯著增加大鼠離體心電圖 QRS 波群的傳導(dǎo)時(shí)間（P ＜ 0.05），表明苯甲地那銨和奎寧可延長(zhǎng)心臟傳導(dǎo)時(shí)程。其中，三種苦味化合物均可顯著增加左心室收縮期（systolic duration）和舒張期（diastolicduration）（P ＜ 0.05）。苯甲地那銨和氯喹均可降低左室內(nèi)壓最大上升速率

圖 4.2 苦味化合物降低大鼠離體心臟的心率（N = 6；N：動(dòng)物數(shù)量；采用 multi grouped t-test，*P < 0.05 表示差異性顯著）。Figure 4.2 Summary data showing that the decrease of heart rate in the presence of bittercompound (N = 6, the number of rats, asterisks indicate multi grouped t-test：*P ＜ 0.05 vs. controlgroup).圖 4.3 苯甲地那銨和奎寧延長(zhǎng)大鼠離體心臟 QRS 間期（N = 6；采用 multi grouped t-test，*P

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2784729