發(fā)布時間：2020-08-08 00:08

【摘要】：研究背景:G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)是細胞膜上的一種7次跨膜受體,能將細胞外刺激轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)信號。GPCR參與生物體內(nèi)多種重要的生理過程,也是重要的藥物靶點�？辔妒荏w(bitter taste receptors,TAS2Rs)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的一員,可以介導舌頭上味蕾細胞的苦味感知過程。最近有文獻報道TAS2Rs不僅在氣管、胃腸道、子宮、膀胱等器官表達,而且具有其特定的生理功能。然而,TAS2Rs在心血管系統(tǒng)的生理和藥理學研究鮮有報道。目前,僅有文獻報道集中在:TAS2Rs在人和嚙齒類動物的心臟表達;TAS2Rs與心臟的代謝和營養(yǎng)傳感(nutrient-sensing)相關(guān),并且介導G蛋白依賴的左心室壓和主動脈壓的降低。因此,TAS2Rs在心臟左心室的表達、功能及信號轉(zhuǎn)導通路亟待研究。研究目標:明確TAS2Rs在大鼠心臟左心室的mRNA表達水平;闡明TAS2Rs對大鼠心臟功能的影響及苦味化合物調(diào)節(jié)心肌收縮的機制。研究方法:利用qPCR實驗檢測大鼠左心室心肌組織和心肌細胞中TAS2Rs亞型的mRNA表達水平;利用Langendorff離體心臟灌流實驗,從離體心臟水平研究苦味化合物(苯甲地那銨、奎寧和氯喹)對大鼠心臟功能的影響,檢測指標為心率、心電圖(electrocardiogram,ECG)和左心室舒縮功能等;利用離體組織浴槽實驗從左心室心肌組織水平,研究預(yù)先給予電刺激(electrical field stimulation,EFS,1 Hz-5 V)或腎上腺素刺激后,苦味化合物(苯甲地那銨、奎寧和氯喹)對大鼠心肌收縮功能的影響;鈣火花是鈣信號的基本單元,是心肌細胞肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum,SR)上鈣釋放通道自發(fā)開放或由L-型Ca~(2+)離子通道開放進一步觸發(fā)引起的局部鈣釋放事件,是心肌興奮-收縮耦聯(lián)的基本單位。在以上功能性實驗的基礎(chǔ)上,利用激光共聚焦實驗研究三種苦味化合物對大鼠心室肌細胞內(nèi)鈣火花釋放頻率的影響,闡明苦味化合物通過激活TAS2Rs降低心肌收縮的機制。研究結(jié)果:大鼠左心室表達6種TAS2Rs亞型,分別為TAS2R108、TAS2R120、TAS2R121、TAS2R126、TAS2R135和TAS2R143。其中TAS2R120表達水平最高,TAS2R108表達水平最低。在大鼠離體心臟水平,苦味化合物苯甲地那銨(0.1-2μM)、奎寧(1-100μM)和氯喹(1-100μM)灌流后可顯著降低大鼠心率(P0.05)。苯甲地那銨和奎寧可顯著增加大鼠離體心電圖QRS波群的傳導時間(P0.05),表明TAS2Rs的激活可延長心臟傳導時程。其中,三種苦味化合物均可增加左心室收縮期(systolic duration)和舒張期(diastolic duration)(P0.05)。苯甲地那銨和氯喹均可降低左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)(P0.05)。奎寧對+dp/dtmax和-dp/dtmax無顯著影響。氯喹顯著降低左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure,LVDP)(P0.05)。50μM的奎寧顯著增加LVDP,當濃度達到100μM時,LVDP迅速降低(P0.05)。苯甲地那銨對LVDP無顯著影響(P0.05)。在組織水平上,系列濃度的苯甲地那銨(10-200μM)、奎寧(10-300μM)和氯喹(10-200μM)可顯著減弱電刺激誘導的心肌收縮(P0.05)。結(jié)果表明,單一濃度(20μM、50μM、100μM、200μM)的苯甲地那銨和奎寧可完全抑制腎上腺素誘導的收縮,其中高濃度(100μM、200μM)的苯甲地那銨和奎寧抑制速度比低濃度(20μM、50μM)快且抑制徹底;500μM的氯喹對腎上腺素誘導的收縮有迅速的抑制作用,隨后這種抑制作用在57.8±21.9 s后消失。這些結(jié)果表明TAS2Rs的激活可顯著降低EFS和腎上腺素誘導的心肌收縮。隨后,利用L-型鈣離子通道抑制劑硝苯地平(nifedipine)、雷尼丁受體(ryanodine receptors)抑制劑丁卡因(tetracaine)、β腎上腺素受體抑制劑普萘洛爾(propranolol)和無鈣緩沖液,探究苦味化合物降低EFS誘導大鼠心肌收縮的機制。結(jié)果表明,EFS增加心肌細胞表面L-型鈣離子通道的開放頻率,引起細胞外的Ca~(2+)經(jīng)L-型鈣離子通道進入心肌細胞。心肌細胞內(nèi)的Ca~(2+)濃度增加,引起更多的Ca~(2+)經(jīng)雷尼丁受體從SR上的鈣庫釋放出來,也被稱作鈣致鈣釋放(calcium-induced calcium release)。L-型鈣離子通道抑制劑硝苯地平可抑制82.3±3.2%電刺激誘導的心肌收縮,隨后加入的三種苦味化合物均可抑制余存的心肌收縮。三種苦味化合物可能降低Ca~(2+)從雷尼丁受體的釋放而降低心肌收縮力。關(guān)于苦味化合物是否通過激活TAS2Rs降低心肌收縮力,實驗結(jié)果顯示,苦味化合物奎寧的競爭性抑制劑GABA可以延緩奎寧對心肌收縮的抑制作用(P0.05)�；谝陨瞎δ苄詫嶒�,我們推測TAS2Rs通過降低心肌細胞內(nèi)Ca~(2+)的釋放,從而降低心肌收縮。利用Fluo 4-AM熒光探針測定苯甲地那銨、奎寧和氯喹對大鼠心室肌細胞內(nèi)鈣火花釋放活動的影響。結(jié)果表明苦味化合物明顯降低鈣火花釋放的頻率(P0.05)。結(jié)論:本研究首次證明了TAS2Rs mRNA在大鼠左心室表達,并揭示TAS2Rs的激活可以減慢心率和心臟的傳導功能;減弱EFS和腎上腺素誘導的心肌收縮。其機制可能為苦味化合物激活TAS2Rs,降低Ca~(2+)經(jīng)雷尼丁受體的釋放頻率,從而減弱心肌收縮。這項研究表明,TAS2Rs激動劑可能是治療室性心動過速和心衰的有效藥物。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R965
【圖文】：

RNA 在大鼠左心室心肌組織和心肌細胞表達（TAS2Rs 的 mRNAPDH；N = 6， N：動物數(shù)量；采用 multi grouped t-test，*P <心肌組織 vs. 心肌細胞）。AS2Rs mRNA are expressed in rat left ventricle tissue and news (Data were presented as relative expression of TAS2R genes to thethe number of rats, asterisks indicate multi grouped t-test：*P ＜ 0.tissue vs. cardiomyocytes).的研究結(jié)果顯示，在新生大鼠的全心共表達 32 種 TAS、TAS2R126、TAS2R135、TAS2R120、TAS2R121 是表過細胞實驗發(fā)現(xiàn)了潛在 TAS2Rs 信號轉(zhuǎn)導通路的重2、瞬時受體電位陽離子通道 5（TRPM5）的表達[63]�；氖倚募〗M織和新分離的心肌細胞中 6 種 TAS2Rs 亞型 TAS2R120、TAS2R121、TAS2R126、TAS2R135、TA

圖 4.1 LVDP 原始記錄。（A）分析每次給藥前 5 min的記錄，LVDP 的變化以給藥后數(shù)據(jù)同對照（100%）的比值表示；（B）放大的 LVDP 原始記錄。Figure 4.1 Original recording of langendorff experiment. (A) The 5 min recordings prior to theaddi-tion of compounds at each concentration were analysed. The LVDP was normalized to thevalues under control conditions (taken as 100%). (B) The original recording in (A) shown in anenlarged time scale.4.4 實驗結(jié)果將苦味化合物苯甲地那銨、奎寧和氯喹分別加入灌流液中進行離體心臟的灌流。實驗結(jié)果表明三種苦味化合物均可顯著減慢大鼠離體心臟的心率 (P ＜ 0.05)，且呈濃度依賴性。苯甲地那銨和奎寧可顯著增加大鼠離體心電圖 QRS 波群的傳導時間（P ＜ 0.05），表明苯甲地那銨和奎寧可延長心臟傳導時程。其中，三種苦味化合物均可顯著增加左心室收縮期（systolic duration）和舒張期（diastolicduration）（P ＜ 0.05）。苯甲地那銨和氯喹均可降低左室內(nèi)壓最大上升速率

圖 4.2 苦味化合物降低大鼠離體心臟的心率（N = 6；N：動物數(shù)量；采用 multi grouped t-test，*P < 0.05 表示差異性顯著）。Figure 4.2 Summary data showing that the decrease of heart rate in the presence of bittercompound (N = 6, the number of rats, asterisks indicate multi grouped t-test：*P ＜ 0.05 vs. controlgroup).圖 4.3 苯甲地那銨和奎寧延長大鼠離體心臟 QRS 間期（N = 6；采用 multi grouped t-test，*P

【參考文獻】

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本文編號：2784729