【摘要】：外泌體是一類由所有細(xì)胞分泌,直徑約為30-150nm的囊泡結(jié)構(gòu)。由于其富含潛在的生物標(biāo)志物,如蛋白質(zhì)、mRNA及miRNA,因此而被認(rèn)為具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。通過分析檢測(cè)外泌體,可以幫助腫瘤的早期診斷、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后分析。另外,由于外泌體是細(xì)胞的內(nèi)源性囊泡,具有免疫原性低、生物可降解性好、毒性低、能穿越血腦屏障等優(yōu)點(diǎn),是藥物遞送的良好載體�；诖�,本論文的主要研究?jī)?nèi)容為:1、基于微流控電化學(xué)平臺(tái),實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤外泌體分離富集與檢測(cè)的研究。我們將易于自動(dòng)化、集成化的微流控芯片與快速、高靈敏和低成本的電化學(xué)相結(jié)合,設(shè)計(jì)了一種集混合、分離富集和檢測(cè)一體的外泌體分析平臺(tái)(ExoPCD-chip)。ExoPCD-chip是由一個(gè)Y型微柱陣列組成的外泌體磁力捕獲區(qū)域和一個(gè)設(shè)計(jì)刻飾的ITO玻璃電極組成。外泌體捕獲主要是采用磁珠修飾的磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合蛋白與外泌體表面暴露的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合;電化學(xué)檢測(cè)是利用具有CD63適配體序列和G-四鏈體序列的發(fā)卡結(jié)構(gòu)進(jìn)行信號(hào)輸出。該芯片只需30 μL樣品,3.5小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè),檢測(cè)限低至4.39×103個(gè)外泌體/mL,檢測(cè)范圍橫跨5個(gè)數(shù)量級(jí)。我們通過ExoPCD芯片對(duì)人血清外泌體進(jìn)行了分析,并成功將肝癌患者與健康對(duì)照區(qū)分開來(lái)。2、CPPs表面修飾外泌體用于藥物遞送的相關(guān)研究。細(xì)胞穿透肽R9通過酰胺反應(yīng)修飾到外泌體表面形成R9-EXO,G3139在靜電吸附和膽固醇錨定的雙重作用下與R9-EXO結(jié)合,形成R9-EXO-G3 139復(fù)合物。該復(fù)合物與肝癌細(xì)胞共孵育后,通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,在細(xì)胞溶酶體的作用下裂解釋放G3139鏈。G3139通過與Bcl-2 mRNA互補(bǔ),下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。R9修飾到外泌體表面,改變了外泌體進(jìn)入細(xì)胞途徑,由膜融合變?yōu)榫W(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用途徑,更好的將外泌體表面的反義寡核酸鏈遞送至細(xì)胞胞內(nèi),遞送效率相對(duì)于未修飾時(shí)提高了 6.03倍。qRCR和Western bolt數(shù)據(jù)表明,R9-EXO-G3139可使Bcl-2 mRNA下調(diào)72.80%,Bcl-2蛋白下調(diào)了69.69%,達(dá)到了沉默腫瘤細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)的目的。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R943;TQ460.1
【圖文】：

用光束照射樣品中的粒子，當(dāng)粒子散射并進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)時(shí)，攝像機(jī)記錄下每個(gè)粒逡逑子的路徑，以確定平均速度和擴(kuò)散率。與ＤＬＳ的體積散射測(cè)量不同，ＮＴＡ跟蹤單個(gè)粒逡逑子的散射（圖１．４）邋＠１。然后該信息用于數(shù)學(xué)計(jì)算濃度（即視場(chǎng)中的顆粒數(shù)）和尺寸分逡逑布（即通過Ｓｔｒｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程的流體動(dòng)力學(xué)直徑，圖１．４ｂ）。然而，為了準(zhǔn)確量化異逡逑質(zhì)囊泡的濃度和大小，ＮＴＡ程序需要精確優(yōu)化相機(jī)和分析設(shè)置�？赡苄枰褂貌煌O(shè)置逡逑

洗脫后的外泌體具有高純度，適用于后續(xù)的生物學(xué)分析的優(yōu)點(diǎn)逡逑金屆離子逡逑圖１．３免疫親和法分離外泌體｜６（）１逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｅｘｏｓｏｍｅｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｉｍｍｕｎｅ邋ａｆｆｉｎｉｔｙ逡逑以上這些方法均受到成本昂貴和分離方法要求的限制。此外，基于免疫親和力的捕逡逑獲只能將外泌體與無(wú)細(xì)胞樣品分離。值得注意的是，在臨床樣本分析過程中，真實(shí)樣本逡逑中的腫瘤異質(zhì)性會(huì)影響免疫捕獲的效率。另一個(gè)相當(dāng)大的問題是使用洗脫緩沖液將外泌逡逑體從免疫復(fù)合物中釋放，洗脫緩沖液的ｐＨ改變，洗滌劑和還原劑的存在可通過膜n蟯稿義閑雜跋焱餉諤騫δ�。山又q廡┰潁庖叻擲肷脅皇視糜諭餉諤宓拇蠊婺７擲敫患郟叮保薄ｅ義希保玻餐餉諤寮觳餳際蹂義隙饃⑸�、ＮＴＡ、Ｔ＿b校印ⅲ牛蹋保櫻�、留|較赴醯確椒ㄊ羌觳夂投客餉諤遄畛Ｓ緬義系姆椒āＴ詒菊陸謚�，晤U墻穌廡┘際醯幕駒懟ｅ義希保玻玻倍饃⑸溴義隙饃⑸洌ǎ模蹋櫻┦且恢鐘糜誆飭啃苤型餉諤宥喔鑫錮硎糶緣撓行Х椒ā＃模蹋渝義喜飭坷醋醞餉諤灞壞ド庠湊丈涫輩拇罅可⑸涔�。悼嚕子经历布涝嚧T�，来走\(yùn)義嫌辛Ｗ擁納⑸涔馇克媸奔潿ǘＡＷ擁畝畔⒗叢從謔笛楣討屑鍬嫉那慷裙旒５膩義獻(xiàn)韻喙兀郟叮玻�。通过阳}錚耄澹螅牛椋睿螅簦澹椋罘匠�，可以将波动率转粦焉颗粒的扩散系数，覄蚍定流辶x咸宥ρе本叮戳魈逯械撓行Э帕３嘰紓遙瑁�。ＤＬＳ诧喛的X汲嘰綬植

本文編號(hào)：2783312