【摘要】：目的:合成并表征新型線粒體靶向化合物BODIPY-TPA(BTPA),研究BTPA靶向線粒體以及對線粒體功能的影響,進(jìn)一步研究BTPA影響線粒體氧化還原平衡與發(fā)揮抗腫瘤作用之間的關(guān)系,探討其可能的作用機(jī)制,期望開發(fā)出集診斷治療于一體的低毒高效的抗腫瘤化合物。方法:設(shè)計(jì)并合成新型線粒體靶向劑BTPA的納米顆粒,使用紫外吸收、熒光光譜、核磁共振以及質(zhì)譜、透射電鏡等方法進(jìn)行表征。使用MitoTracker Red以及Hoechst33342熒光探針共定位檢測其線粒體靶向性,以不同濃度的BTPA處理MCF-7,Patu8988,MFC,AGS,BGC-823五種腫瘤細(xì)胞24h,MTT法檢測細(xì)胞活度,計(jì)算抑制率并計(jì)算IC_(50)值,并比較BTPA對正常人上皮細(xì)胞HUVEC與腫瘤細(xì)胞的毒性。在體水平上,構(gòu)建胃癌小鼠荷瘤模型,腹腔注射不同濃度的BTPA以及陽性對照藥五氟尿嘧啶(5-Fu),小鼠處死后取腫瘤組織以及免疫器官評價(jià)內(nèi)臟指數(shù)。通過HE染色以及免疫組化分析BTPA對腫瘤組織以及細(xì)胞增殖蛋白PCNA的影響,分子docking實(shí)驗(yàn)分析BTPA與線粒體硫氧還蛋白還原酶TrxR2的結(jié)合力,western blot檢測細(xì)胞中以及腫瘤組織中TrxR2的表達(dá),試劑盒檢測總的硫氧還蛋白還原酶TrxR的活性,MDA試劑盒檢測細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化水平,線粒體功能相關(guān)檢測包括JC-1探針檢測線粒體膜電位,試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ATP水平,Clark氧電極用于檢測細(xì)胞內(nèi)耗氧量水平。試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)CAT、GSH、SOD以及Mn-SOD水平,研究BTPA對線粒體氧化還原平衡的影響。DHE以及MitoSOX探針檢測細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)的活性氧累積情況。Hoechst,Annexin V/PI檢測細(xì)胞凋亡,并使用NAC預(yù)作用分析細(xì)胞凋亡的可能誘因。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測凋亡相關(guān)蛋白以及PI3K/Akt這條信號通路的變化,研究BTPA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。結(jié)果:紫外結(jié)果顯示BTPA的最大紫外可見吸收波長為為513 nm,最大發(fā)射波長為509 nm,核磁共振氫譜顯示了典型的BTPA峰,質(zhì)譜圖譜顯示出M/Z=601.46(100)的主要分子離子峰為[(BTPA-F)+CH3CN+2H~+]~+,透射電鏡顯示我們獲得了形態(tài)均勻形貌完整的BTPA的納米顆粒,熒光共定位實(shí)驗(yàn)顯示其可以選擇性地定位腫瘤細(xì)胞線粒體。BTPA對人胃癌細(xì)胞BGC-823的IC_(50)數(shù)值在36.7μM左右,對正常的上皮細(xì)胞HUVEC的IC_(50)數(shù)值在113.2μM左右。在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BTPA在不影響小鼠體重正常器官(脾臟,胸腺,肝)的條件下呈現(xiàn)較為顯著的抑制腫瘤增長的作用。腫瘤組織免疫組化以及HE染色結(jié)果也同樣驗(yàn)證了BTPA的抗胃癌增殖作用。分子docking實(shí)驗(yàn)顯示BTPA與線粒體TrxR2的結(jié)合力評分為-6.93,并且western blot實(shí)驗(yàn)顯示BTPA在離體和在體水平上都下調(diào)了TrxR2的表達(dá),但是對胞漿的TrxR1沒有影響,細(xì)胞內(nèi)總的TrxR的活性沒有顯著差異,但是細(xì)胞仍然產(chǎn)生了強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激表現(xiàn)為明顯的MDA的提高。線粒體功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示BTPA處理后,胃癌細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的線粒體功能障礙,表現(xiàn)為下降的線粒體膜電位以及降低的細(xì)胞ATP以及被抑制的細(xì)胞呼吸。除此之外,細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)包括CAT,GSSG和GSH以及Mn-SOD都出現(xiàn)明顯的下調(diào),表現(xiàn)為線粒體抗氧化能力的下調(diào)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PI3K/Akt這條信號通路被下調(diào),細(xì)胞ROS以及線粒體ROS出現(xiàn)明顯的累積,BTPA引起了濃度依賴性的細(xì)胞凋亡,并且是線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡。而NAC的預(yù)作用抑制了這種凋亡的產(chǎn)生。說明氧化應(yīng)激是BTPA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的直接原因。結(jié)論:BTPA具有良好的線粒體靶向性,并且具有良好的抗胃癌作用。這種抗腫瘤活性可能與線粒體氧化還原平衡的破壞有關(guān),表現(xiàn)為TrxR2的下調(diào)以及線粒體抗氧化能力的下調(diào),細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激,進(jìn)一步下調(diào)PI3K/Akt這條信號通路,進(jìn)一步加劇細(xì)胞內(nèi)活性氧的累積,形成線粒體氧化還原平衡內(nèi)的惡性循環(huán)。導(dǎo)致線粒體功能障礙,誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96
【圖文】：

9圖 1.1 線粒體與癌癥(引自[67])Fig. 1.1 Mitochondrial and cancer除此之外，瓦博格關(guān)于癌細(xì)胞的代謝方式還有一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)，即在氧氣充足的條件下機(jī)體仍將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，進(jìn)行無氧糖酵解，而不是完全氧化葡萄糖以促進(jìn)線粒體呼吸，也就是廣為人知的“瓦博格效應(yīng)”[61]。這引起了人們對線粒體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的關(guān)注。線粒體參與無氧糖酵解這一過程表明線粒體在調(diào)節(jié)氧化磷酸化與糖酵解代謝中起著積極和直接的作用。雖然“瓦博格效應(yīng)”是許多（但不是所有）癌細(xì)胞無可爭議的特征，但瓦博格認(rèn)為它是由線粒體呼吸受損引起的，這引起了當(dāng)時(shí)很大的爭議。我們現(xiàn)在了解到，雖然受損的線粒體在某些情況下會產(chǎn)生瓦博格效應(yīng)[72]，但許多研究結(jié)果顯示擁有瓦博格代謝方式的癌細(xì)胞仍然擁有完整的線粒體呼吸，其中

的生物學(xué)功能，因?yàn)?mtDNA 中的突變影響著腫瘤發(fā)生發(fā)響腫瘤發(fā)生發(fā)展存活和轉(zhuǎn)移的重要細(xì)胞器，除了產(chǎn)生能量方面都有助于腫瘤的進(jìn)展。上述線粒體生物學(xué)的這些方面體在癌癥中的多效性功能。因此，為了有效治療癌癥，了量代謝對于推進(jìn)癌癥治療非常重要[84]。氧化還原穩(wěn)態(tài)抗腫瘤生物學(xué)功能和癌癥之間的聯(lián)系歷來集中在新陳代謝上，但獻(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了新陳代謝[85]。腫瘤細(xì)胞代謝反應(yīng)產(chǎn)生一系羥基自由基以及過氧化氫，線粒體是其主要貢獻(xiàn)者[86]，并途徑來清除 ROS，包括超氧化物歧化酶（SOD2），谷胱甘酶[87]。

NADPH 氧化酶的電子傳遞都會導(dǎo)致 ROS 產(chǎn)生，高水平的 ROS 有助于大分子（例如脂質(zhì)，蛋白質(zhì)和 DNA）的氧化，并且可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性[72]。然而，在許多腫瘤中觀察到適度的 ROS 升高可通過半胱氨酸氧化來調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)。實(shí)際上，H2O2 通過氧化半胱氨酸殘基的活性位點(diǎn)而使腫瘤抑制因子 PTEN 失活，從而形成二硫鍵，進(jìn)而阻止 PTEN 對 PI3K 信號通路的抑制，激活 PI3K 途徑[89]。由于 ROS 可以通過半胱氨酸殘基的氧化來抑制蛋白酪氨酸磷酸酶，因此 ROS 可能對通常被磷酸酶抑制的其他途徑具有激活作用。腫瘤細(xì)胞為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，應(yīng)對 ROS 水平的升高，通常會上調(diào)抗氧化途徑[90]。例如，致癌 K-Ras，B-raf 和 c-Myc 通過調(diào)節(jié)核因子 NRF2（一種抗氧化反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）來促進(jìn)腫瘤發(fā)生，抑制 ROS 的生成[91]。一項(xiàng)有關(guān)黑色素瘤研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移部位腫瘤細(xì)胞的 NADPH 水平高于原發(fā)腫瘤部位，這可能是腫瘤細(xì)胞為了對抗轉(zhuǎn)移應(yīng)激引起的 ROS 增加。類似地，抗氧化劑谷胱甘肽的治療增加了惡性黑色素瘤小鼠模型中的腫瘤轉(zhuǎn)移[92]。因此，維持 ROS 水平在一定范圍內(nèi)對腫瘤細(xì)胞的存活以及轉(zhuǎn)移是至關(guān)重要的，在該范圍內(nèi)既可以刺激細(xì)胞增殖又不引起細(xì)胞毒性。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 杜夏;新型線粒體靶向劑BODIPY-TPA的抗胃癌作用及其機(jī)制研究[D];江蘇大學(xué);2019年

本文編號：2782672