【摘要】：Rho激酶(ROCK1和ROCK2)屬于AGC家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它是第一個被發(fā)現(xiàn)的Rho蛋白下游效應因子,其通過磷酸化下游的效應蛋白(MLC、Lin-11、Isl-1、LIMK、ERM、MARCKS、CRMP-2等)來實現(xiàn)其生物學功能。大量的研究證明,ROCKs參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展,如心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等,因此ROCKs被認為是一類重要的藥物研發(fā)的靶點。盡管大量的ROCKs小分子抑制劑已經(jīng)被報道,但大都不是理想的先導化合物,目前僅有法舒地爾在日本被批準上市用于治療腦血管痙攣和缺血。因此,研發(fā)和設計新穎的、藥效強的以及副作用小的ROCKs抑制劑具有非常重要的意義。本論文首先采用分子對接的方法對ChemBridge和Specs化合物數(shù)據(jù)庫中的化合物進行篩選。接著,挑選并購買了174個化合物進行ROCK1激酶活性實驗和細胞活性實驗,其中12個類藥性化合物顯示出微摩范圍的抑制活性(IC50值在7μM到28μM之間),并且在體外具有明顯的抑制肺癌細胞、乳腺癌細胞和骨髓瘤細胞增值的活性;最后結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果顯示2個化合物(化合物13和24)具有新穎的結(jié)構(gòu)。此外,藥理學實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物24在斑馬魚體內(nèi)能夠有效地預防及治療阿托伐他汀引起的腦出血,可以作為治療腦出血疾病的潛在候選先導化合物。在第三和第四章中,采用分子對接、分子動力學模擬、MM/GBSA結(jié)合自由能計算和自由能分解的方法,從原子水平研究了ROCK1與三嗪類抑制劑以及LIMK2與吡咯并嘧啶類抑制劑的結(jié)合模式,研究了蛋白受體在與抑制劑結(jié)合過程中構(gòu)象的動態(tài)變化,并分析了受體重要氨基酸殘基及抑制劑的不同取代基對抑制劑結(jié)合的作用。根據(jù)理論預測的結(jié)果,我們設計了一系列新穎的抑制劑,并且對設計抑制劑進行理論的驗證,發(fā)現(xiàn)這些抑制劑表現(xiàn)出較強的結(jié)合親和力,可能具有更優(yōu)的活性。在第五章中,我們對虛擬篩選得到的ROCK抑制劑FPND的預防腦出血機制進行了深入的藥效學和藥理學研究。FPND具有新穎的骨架結(jié)構(gòu)并且在微摩爾的濃度下具有明顯的抑制活性。首先我們采用分子動力學模擬、MM/GBSA結(jié)合自由能計算和自由能分解方法對FPND對ROCK1和ROCK2的選擇性抑制的根源進行了探討;結(jié)果發(fā)現(xiàn)FPND與ROCK1和ROCK2之間的結(jié)合親和力的差異主要是由非極性能量項貢獻的。在斑馬魚模型中,我們發(fā)現(xiàn)該化合物對阿托伐他汀誘導的腦出血具有明顯的保護作用以及顯著防止內(nèi)皮細胞破裂的作用;最后,xCELLigence RTCA系統(tǒng)分析,免疫熒光和Western印跡分析的結(jié)果表明這種預防及保護的作用是通過抑制ROCK/MYPT1/MLC2、ROCK/LIMK/絲切蛋白和Src/VEC信號通路來完成的�？偠灾�,FPND是一個低毒安全的,并能有效的預防腦出血的候選先導化合物。在最后一章中,我們采用并行虛擬篩選以及相似性搜索的篩選策略對Chembridge化合物進行了虛擬篩選,并結(jié)合子結(jié)構(gòu)匹配方法獲得及挑選了79個可能的ROCK1小分子抑制劑。激酶抑制實驗證明其中有21個化合物對ROCK1具有明顯的抑制活性,其中有4個化合物的IC50值低于0.5μM。此外,我們發(fā)現(xiàn)在這些抑制劑中有17個化合物具有新穎的母核結(jié)構(gòu)—吡咯并吡啶基,分子模擬結(jié)果證明該母核結(jié)構(gòu)對抑制劑的活性是不可或缺的。此外,實驗還證明了化合物TS-15和TS-40在細胞中能夠通過抑制ROCK的活性來抑制ROCK下游效應蛋白絲切蛋白的磷酸化程度,并且它們在斑馬魚體內(nèi)具有預防和治療斑馬魚腦出血的效果�？偠灾�,并行虛擬為藥物設計提供了一個新的策略。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R91

【參考文獻】

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1 張愛華;全正翔;劉福中;;法舒地爾對急性缺血性腦卒中患者血液流變學的影響[J];中南藥學;2008年03期

本文編號：2782436