【摘要】：腫瘤是由于某些情況下,細(xì)胞的增殖和凋亡發(fā)生異常而形成,主要受細(xì)胞中抑癌基因和原癌基因的調(diào)控,二者相互聯(lián)系又相互制約,任何一環(huán)節(jié)失控都可能會導(dǎo)致細(xì)胞癌變。其中,P53作為一種與腫瘤相關(guān)性最高的抑制因子,大約50%的腫瘤中發(fā)生了P53基因突變。P53基因是調(diào)控保護(hù)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)移主要通路,具有抑制或阻止細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化及保護(hù)基因組穩(wěn)定的作用。MDM2是目前研究較多的癌基因,MDM2蛋白能夠與P53蛋白的酸性結(jié)構(gòu)域和部分轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域發(fā)生結(jié)合,形成p53-MDM2復(fù)合物,而抑制P53的正常功能,進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。理論上,通過阻止MDM2對P53的相互作用,可以激活腫瘤細(xì)胞中p53信號途徑。因此抑制p53-MDM2之間的相互作用被認(rèn)為是抗腫瘤的重要藥靶之一,以此為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物的發(fā)現(xiàn)和篩選。另外,據(jù)文獻(xiàn)報道,吲哚類生物堿具有較好的抗腫瘤活性,本研究主要探究其是否對p53-MDM2靶點(diǎn)是否具有抑制效果,從而尋找出靶向p53抗腫瘤的新型吲哚類生物堿抑制劑。本研究設(shè)計以p53-MDM2為靶點(diǎn),通過運(yùn)用生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(bioluminescence resonancetransfer,BRET)技術(shù),構(gòu)建p53-MDM2相互作用的模型,將前期課題組合成的活性較好的吲哚類生物堿小分子化合物作用于該模型,進(jìn)而得出吲哚類生物堿小分子化合物是否對p53-MDM2靶點(diǎn)具有抑制作用,最終篩選出靶向p53抗腫瘤吲哚類生物堿小分子化合物的先導(dǎo)化合物。本研究主要分為以下三個部分:第一部分,課題組前期已用wt P53 A549細(xì)胞對合成的40余個吲哚類生物堿小分子化合物體外抗腫瘤活性初步篩選得到了半數(shù)抑制率濃度(IC_(50))與所測陽性化合物Nutlin-3進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,化合物2yy(IC_(50)=15.57μM)和3zz(IC_(50)=10.84μM)對A549細(xì)胞的抑制活性都優(yōu)于陽性對照化合物Nutlin-3。因此可以初步推測化合物2yy和3zz在細(xì)胞活性和靶向p53抗腫瘤選擇性上可能具有較好的效果,可繼續(xù)研究其對p53-MDM2相互作用的影響。第二部分,p53-MDM2相互作用BRET模型的構(gòu)建。首先將P53和MDM2基因分別克隆至含熒光蛋白基因EGFP和熒光素酶基因Rluc的載體上,分別形成融合質(zhì)粒后,按照一定比例共轉(zhuǎn)HEK293細(xì)胞進(jìn)行融合蛋白表達(dá),加入熒光素酶底物后,檢測BRET信號,以此可以判斷p53-MDM2互作效果及小分子化合物破壞其相互作用的能力。最后,用陽性化合物作對照來驗證p53-MDM2互作BRET模型,最終結(jié)果表明p53-MDM2互作BRET模型是構(gòu)建成功的,可用于前期吲哚類生物堿小分子化合物的作用機(jī)制研究。第三部分,具有活性的吲哚類生物堿小分子化合物對p53-MDM2相互作用的機(jī)制研究。將前期MTT法篩選出的活性較好的吲哚類生物堿小分子化合物作用于p53-MDM2互作BRET模型,研究這些小分子化合物對p53-MDM2互作機(jī)制的影響。結(jié)果表明,吲哚類生物堿小分子化合物3zz對P53與MDM2相互作用具有較好的抑制效果,可作為靶向p53抗腫瘤藥物研發(fā)先導(dǎo)化合物進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96
【圖文】：

已經(jīng)通過不同的方法闡明了P53與MDM2之間相互作用的位點(diǎn)（Kussie et al.,1996;Lane et al.,1997;Prives et al.,1999;Lohrum M Aet al., 2003）。截至目前為止主要是通過了三條途徑來抑制腫瘤造成的 MDM2 蛋白的過度表達(dá)，達(dá)到釋放 P53 或激活 P53 途徑：（1）抑制 MDM2 作為一種 E3 泛素連接酶導(dǎo)致 P53 降解的功能；（2）阻止 P53 與 MDM2 的結(jié)合；（3）抑制 MDM2 基因的表達(dá)功能，從而降低細(xì)胞中 MDM2 蛋白的濃度。由于 MDM2 是P53 的主要調(diào)控因子，當(dāng)前應(yīng)用最普遍的方法是懫用具有 MDM2 蛋白特異性結(jié)合能力的小分子化合物，將其與 MDM2 蛋白上的 P53 結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合來達(dá)到抑制二者相互結(jié)合的功能，此研究的基礎(chǔ)是當(dāng)前得到廣泛接受的 P53 與 MDM2 復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)模型。對 P53 N 端的 11個氨基酸和 MDM2 N 端 109 個氨基酸片段形成的復(fù)合物晶體的 X 衍射分析表明，MDM2的P53結(jié)合區(qū)域含有由疏水性氨基酸殘基及芳香性通過兩性α-螺旋和β-折疊形成的一個深層的疏水性裂隙，當(dāng) P53 上的結(jié)合位點(diǎn)接近 MDM2 時，被其誘導(dǎo)形成一個擁有 2.5 螺旋的兩性α-螺旋(Chen et al., 1993)，它的疏水面直接插入 MDM2 的裂隙中(圖 1-1)(劉雄偉，2018)。

中重要的含氮堿性有機(jī)化合物堿在自然界中廣泛存在，是迄今性，大多數(shù)吲哚生物堿具有重、抗病毒和治療高血壓等。目前時其抗腫瘤作用也在治療癌癥研究抗腫瘤活性較好的吲哚類哚類生物堿等四大類（張文會找抗腫瘤藥物以及靶向小分子，吲哚并喹唑啉酮類化合物，ctoria L 的根，具有鎮(zhèn)痛和解毒2、卵巢癌 A2780 細(xì)胞有較好端粒酶活性的表達(dá)以及能夠逆

圖 1-4 四氫哌啶[2, 3-b]吲哚類化合物Fig. 1-4 Hexahydro-1H-pyrido[2, 3-b]indol scaffolds第三類單萜吲哚類生物堿，如喜樹堿類化合物。1966 年，Wall(Wall, M., et al.,1966)首山茱萸目珙桐科植物喜樹中分離得到了吲哚類生物堿，即喜樹堿(Camptothecin, CPT，-5），據(jù)報道此類生物堿具有抗腫瘤的作用。1985 年，拓?fù)洚悩?gòu)酶 I (TopoisomeraseI, Topo特異性抑制劑是喜樹堿被 Hsiang 等人發(fā)現(xiàn)，這一研究發(fā)現(xiàn)極大引起了人們對喜樹堿的，已成為國內(nèi)外抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。當(dāng)前，用于臨床中具有明顯抗癌作用的喜樹堿

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本文編號：2778603