【摘要】：類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種以多關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要特征的系統(tǒng)性自身免疫疾病,常伴關(guān)節(jié)外器官受累及血清類風濕因子陽性,最終導致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失,高發(fā)于30-50歲的女性,發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。目前臨床上RA的治療以藥物治療和手術(shù)治療為主,但手術(shù)治療易造成關(guān)節(jié)腔二次損傷,滑膜的切除使關(guān)節(jié)失去了合成滑液的基本功能,進一步加劇了關(guān)節(jié)功能的受損。甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)是臨床一線的抗風濕藥,具有免疫抑制、抗炎作用,能夠減輕疼痛、緩解癥狀、控制病情發(fā)展。但因其在體內(nèi)的非特異性分布,使得進入炎癥關(guān)節(jié)部位的藥物分子數(shù)量有限,而在正常組織中大量分布,服用高劑量甲氨蝶呤常產(chǎn)生潰瘍性口腔炎、腹瀉甚至致命的腸穿孔等毒副作用,嚴重影響了患者的生活質(zhì)量,而低劑量的治療又嚴重制約RA療效,且長期小劑量使用僅能延緩骨質(zhì)侵蝕的進展,而不能阻止長期炎癥反應導致的骨質(zhì)疏松的發(fā)生,更不能促進已受損骨質(zhì)的修復與再生。新型納米給藥系統(tǒng)是改善藥物體內(nèi)分布,降低藥物毒副作用的有效手段,且可通過載體材料的功能化實現(xiàn)RA的多靶點治療。唾液酸(SialicAcid,SA)是一類位于細胞膜最外層的九碳糖,可與E選擇素特異性結(jié)合,且唾液酸化的糖復合物可通過抑制破骨細胞成熟,促進成骨細胞分化,進而促進骨的修復和再生。本研究采用唾液酸、葡聚糖和硬脂酸為原料合成了唾液酸-葡聚糖-硬脂酸(SA-Dex-OA,SDO)嫁接物;SDO可在水性介質(zhì)中自組裝形成膠束,臨界膠束濃度(Critical micelle concentration,CMC)為 55.06 μg/mL,膠束粒徑為75.20 ± 11.91 nm,膠束能有效負載抗類風濕藥物MTX,包封率為89.39 ±0.26%。唾液酸-葡聚糖-硬脂酸載藥膠束(SA-Dex-OA/MTX,SDM)粒徑為117.33±5.77 nm,載藥膠束對藥物有明顯的緩釋效應,藥物可持續(xù)釋放48 h以上。以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)為模型細胞,對嫁接物的細胞毒性進行考察,結(jié)果顯示其在1-1000 μg/mL濃度范圍內(nèi)對細胞的生長及增殖均無影響,細胞毒性較低。采用脂多糖刺激HUVEC構(gòu)建E-選擇素受體高表達的體外炎癥細胞模型用于考察SDO嫁接物膠束的主動靶向能力,以葡聚糖-硬脂酸(Dex-OA,DO)嫁接物膠束為對照,結(jié)果表明炎癥HUVEC對SDO嫁接物膠束具有更好的攝取行為;采用游離唾液酸阻斷細胞表面E-選擇素受體后,炎癥細胞對SDO嫁接物膠束的攝取量降低;E-選擇素熒光與SDO膠束熒光信號呈現(xiàn)共定位現(xiàn)象,證實SDO嫁接物膠束的炎癥血管內(nèi)皮細胞主動轉(zhuǎn)運是由SA與E-選擇素的特異性結(jié)合所介導的。以小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)為模型細胞,對嫁接物的骨修復與再生作用進行考察,結(jié)果顯示SDO嫁接物膠束可通過唾液酸介導的促胞內(nèi)堿性磷酸酶活力和胞外礦化結(jié)節(jié)形成,促進成骨細胞分化和礦化。采用膠原誘導關(guān)節(jié)炎法構(gòu)建大鼠RA模型,尾靜脈給藥考察包載熒光探針的嫁接物膠束在模型動物體內(nèi)的分布情況,結(jié)果顯示SDO嫁接物膠束可通過唾液酸與炎癥關(guān)節(jié)周圍血管內(nèi)皮細胞表面高表達E選擇素的特異性結(jié)合,實現(xiàn)在炎癥關(guān)節(jié)部位的大量蓄積。經(jīng)尾靜脈注射給藥14天后,SDM組足爪腫脹程度顯著減輕,關(guān)節(jié)炎評分指數(shù)顯著下降;滑膜組織增生和胞內(nèi)線粒體腫脹情況得到有效抑制,顯著改善了細胞缺血缺氧狀態(tài);同時炎性細胞浸潤程度明顯減輕,TNF-a和IL-6的合成和釋放能力顯著降低,炎癥反應得到有效抑制。另外,SDM載藥膠束還可通過唾液酸介導的骨修復調(diào)控作用,上調(diào)OPG表達,下調(diào)RANKL表達,使骨代謝向骨形成傾斜,提高骨密度,發(fā)揮骨修復與再生作用;MTX給藥14天后,血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮和血肌酐的濃度顯著升高,對肝腎均有一定毒性,而SDM組生化指標與正常組接近,顯示SDM載藥膠束的安全性。納米羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP)作為骨骼的天然組分之一,具有生物粘附性強、可吸附藥量大、酸敏感、骨誘導性能良好等特性,是優(yōu)良的人體骨仿生再生材料。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,以具有修復軟骨作用的殼寡糖為膠束主要材料,通過酰胺反應合成唾液酸-殼寡糖-脫氧膽酸嫁接物膠束(SA-CSO-DA,SD);SD可在水性介質(zhì)中自組裝形成膠束,CMC為38.45 μg/mL;以具有較好表面活性劑特性的該嫁接物膠束作為穩(wěn)定劑,通過水熱法制得棒狀的唾液酸修飾殼寡糖/羥基磷灰石(SH)納米粒,大小均一,粒徑約為30.03±6.54nm;該納米�？捎行組TX,制得的載藥納米粒(SHM)外觀仍呈棒狀,分布均一,粒徑大小增加至46.08 ± 7.88 nm,包封率為68.67±2.80%。體外釋放結(jié)果顯示,SHM呈現(xiàn)明顯的酸敏感釋放特性,在pH 7.4中性介質(zhì)中釋放緩慢,而在pH 5.5酸性條件下釋放加快,48h內(nèi)的累積釋放百分率可達87.95%左右。以原代大鼠軟骨細胞為模型細胞,考察SH納米粒的促軟骨修復作用,結(jié)果表明,SH納米粒具有較低的細胞毒性;IL-1β刺激的原代大鼠軟骨細胞經(jīng)SH處理后,凋亡細胞的比例顯著降低,糖胺多糖含量顯著增加,Ⅱ型膠原表達明顯上調(diào),而HAP預處理基本不影響凋亡細胞比例、糖胺多糖含量和Ⅱ型膠原的表達。以原代成骨細胞為模型細胞,考察SH納米粒的促成骨修復與再生作用,結(jié)果顯示,與SH共孵育后,胞內(nèi)堿性磷酸酶活力明顯增強,礦化結(jié)節(jié)數(shù)目顯著增加,Ⅰ型膠原和OPG表達明顯上調(diào),顯著促進了成骨細胞的分化及礦化進程。采用膠原誘導關(guān)節(jié)炎法建立RA模型,SH納米粒經(jīng)靜脈給藥后,其可有效分布至靶部位,實現(xiàn)在炎癥關(guān)節(jié)部位的大量蓄積;經(jīng)尾靜脈注射給藥28天后,SHM組足爪腫脹程度顯著減輕,關(guān)節(jié)炎評分指數(shù)顯著下降;脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)有效降低,免疫功能亢進情況得到顯著改善,同時滑膜組織中炎性細胞合成和釋放TNF-α和IL-6的量顯著降低,炎癥反應得到有效抑制;還可通過補充軟骨組織中糖胺多糖含量、上調(diào)Ⅱ型膠原表達及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性,發(fā)揮促軟骨修復作用;SHM納米給藥系統(tǒng)可通過上調(diào)骨形成階段關(guān)鍵蛋白OPG、下調(diào)破骨細胞激活因子RANKL,使新骨生成速度顯著加快,顯著增加骨質(zhì)及骨量,實現(xiàn)骨修復與再生作用;MTX給藥28天后,血清中尿素氮的濃度和谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶比值顯著升高,對肝腎均有一定毒性,而SHM組生化指標與正常組接近,肝臟和腎臟無明顯病變區(qū)域,顯示SHM納米給藥系統(tǒng)安全性較高。本研究構(gòu)建的功能性甲氨蝶呤納米給藥系統(tǒng)均能通過藥物向炎癥關(guān)節(jié)部位的靶向遞送,實現(xiàn)類風濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應的有效抑制,同時,殘留的殼寡糖可促進軟骨修復;納米羥基磷灰石協(xié)同唾液酸,發(fā)揮成骨修復與再生功能,最終實現(xiàn)類風濕性關(guān)節(jié)炎的安全高效治療,為RA治療方法提供新策略和新思路。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R943
【圖文】：

邐４．０逡逑ＬｏｇＣ（ｐｇ／ｍＬ）逡逑圖１．４１＾１３值隨嫁接物濃度的變化而變化逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．４邋Ｔｈｅ邋ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ邋ｒａｔｉｏ邋（Ｉ１／Ｉ３）邋ａｓ邋ａ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ逡逑ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＳＡ－Ｄｅｘ－ＯＡ邋ａｎｄ邋Ｄｅｘ－ＯＡ邋ｍｉｃｅｌｌｓ．逡逑１．３．２．４唾液酸？■葡聚糖－硬脂酸嫁接物膠束的理化性質(zhì)表征逡逑本研究采用動態(tài)光散射法測定嫁接物濃度為１邋ｍｇ／ｍＬ時，ＤＯ和ＳＤＯ空白膠逡逑束的粒徑分別為７４．００±８．６４和７５．２０±１１．９１邋ｎｍ邋（圖１．５），且兩者之間無顯著性差逡逑異，表明ＳＡ修飾對嫁接物膠束的粒徑基本無影響。逡逑ＳＤＯ邋Ｍｉｃｅｌｌｅｓ逡逑０１邐—逡逑１邋Ｓｉｚｅ邋（ｄ．邋ｎｍ）１０邐１０0逡逑ＤＯ邋Ｍｉｃｅｌｌｅｓ逡逑１酵~|Ｉ逡逑ｆ３０邋Ｉ逡逑－ｍｌ逡逑0邋—邐＞邐？邐？邋＂邋＞邋＞邋Ｍ邐Ｉ邋ｔ邐Ｉ邐ｔ邋ｔ逡逑＇Ｓｉｚｅ邋（ｄ．邋ｎｍ）１０逡逑圖１．５嫁接物

１．３．３．１載藥膠束的粒徑分布考察及形貌觀察逡逑當嫁接物的濃度為１邋ｍｇ／ｍＬ時，載藥膠束ＳＤＭ和ＤＭ的粒徑分布和形態(tài)如逡逑圖１．６所示。結(jié)果表明：與空白膠束相比，ＳＤＭ和ＤＭ載藥膠束的粒徑均增大，逡逑分別為１１７．３３±５．７７ｎｍ和１１８．９０±３９．１９ｎｍ。造成粒徑增大的可能原因是載藥后，逡逑膠束的疏水內(nèi)核空間增大；ＴＥＭ圖片顯示，ＳＤＭ和ＤＭ呈類球形，粒徑分布均逡逑一；載藥膠束的粒徑均略小于動態(tài)光散射法測到的水合粒徑，可能原因為在制備透逡逑射電鏡樣品過程中，親水性外殼發(fā)生皺縮。逡逑ＳＤＭ邋Ｍｉｃｅｌｌｅｓ逡逑４０［逡逑ｇ３。．邐４逡逑丨Wｉ逡逑１邋Ｓｉｚｅ（ｄ．邋ｎｍｊ１0邐１00逡逑ＤＭ邋Ｍｉｃｅｌｌｅｓ逡逑丨Wｉ逡逑１邋Ｓｉｚｅ邋（ｄ．邋ｎｍ）邋１０邐１００逡逑圖１．６嫁接物載藥膠束ＳＤＭ和ＤＭ的粒徑分布和形態(tài)觀察逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．６邋Ｓｉｚｅ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ＴＥＭ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ＳＤＭ邋ｍｉｃｅｌｌｅｓ邋（ｕｐ）邋ａｎｄ邋ＤＭ逡逑ｍｉｃｅｌｌｅｓ邋（ｂｏｔｔｏｍ）逡逑１．３．３．２載藥膠束載藥量、包封率測定及體外釋放行為研究逡逑本研究采用高效液相色譜法對ＳＤＭ載藥膠束的載藥量和包封率進行測定，以逡逑ＤＭＳＯ為提取藥物的有機溶劑，當ＤＭＳＯ與ＳＤＭ膠束溶液以９邋：邋１邋（ｖ／ｖ）的比例逡逑混合時，膠束的結(jié)構(gòu)發(fā)生反轉(zhuǎn)，位于疏水內(nèi)核中的ＭＴＸ溶解進入ＤＭＳＯ中，采逡逑用高效液相色譜法測定樣品中藥物濃度

為研究ＳＡ的嫁接對ＳＤＭ載藥膠束藥物釋放的影響，本研究以含１０％胎牛血逡逑清的ＰＢＳ邋（ｐＨ邋７．４）為釋放介質(zhì)，采用透析袋法對ＳＤＭ和ＤＭ載藥膠束的體外釋逡逑放行為進行表征。結(jié)果如圖１．７所示，結(jié)果表明：與游離ＭＴＸ相比，ＳＤＭ和ＤＭ逡逑載藥膠束的藥物釋放呈現(xiàn)明顯的雙相釋放特征，前８ｈ釋放相對較快，此后藥物釋逡逑放相對緩慢，藥物釋放時間可延長至４８ｈ，且兩者的釋放行為未見顯著性差異。逡逑＾１00－｜邋＊逡逑Ｑ）邋Ｉ逡逑＜Ｓ邋８０＊邋Ｊ逡逑｜邋４0－邋／逡逑￣邐－邋－邋Ｄｅｘ－ＯＡ／ＭＴＸ邋ｉｎ邋１０％ＦＢＳ／ＰＢＳ逡逑＊５邐２０＇邋：邐一邋Ｆｒｅｅ邋ＭＴＸ１０％邋ｉｎ邋１０％ＦＢＳ／ＰＢＳ逡逑Ｅ邐—邋ＳＡ－Ｄｅｘ－ＯＡ／ＭＴＸ邋ｉｎ邋１０％ＦＢＳ／ＰＢＳ逡逑0邋0邋Ｉ邐■邐■邐■邐■逡逑０邐１５邐３０邐４５邐６０逡逑Ｔｉｍｅ邋（ｈ）逡逑圖１．７邋ＳＤＭ和ＤＭ載藥膠束的藥物釋放行為逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．７邋Ｄｒｕｇ邋ｒｅｌｅａｓｅ邋ｂｅｈａｖｉｏｒｓ邋ｏｆ邋ＳＤＭ邋ａｎｄ邋ＤＭ邋ｍｉｃｅｌｌｅｓ逡逑１．４本章小結(jié)逡逑以ＤＣＣ為脫水劑，ＤＭＡＰ為催化劑，己二胺為橋鏈，通過ＯＡ上羧基和ＳＡ逡逑上羥基與Ｄｅｘ上羥基間的取代反應，成功合成了唾液酸－葡聚糖－硬脂酸嫁接物逡逑（３００）。采用芘熒光法測得３００嫁接物的臨界膠束濃度為５５．０６＾＾／１１＾。８００嫁逡逑接物可有效負載抗類風濕藥物ＭＴＸ，包封率為８９．３９±０．２６％。所制備得到的ＳＤＭ逡逑載藥膠束外觀呈類球形，分布均一，粒徑較載藥前略有增大。體外釋放結(jié)果顯示，逡逑ＳＤＭ載藥膠束呈現(xiàn)明顯的緩釋特征

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