【摘要】：惡性腫瘤是我國(guó)居民死亡的主要原因之一,近20年來(lái),研究者逐漸將研究重點(diǎn)放在腫瘤特異性免疫治療上,即通過(guò)腫瘤疫苗來(lái)治療腫瘤,并在這方面取得了一些進(jìn)展,免疫療法應(yīng)該是目前對(duì)人體毒性傷害最小的療法。免疫治療主要通過(guò)兩種途徑抑制腫瘤:一種是在腫瘤發(fā)生過(guò)程中誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答;另一種是對(duì)腫瘤進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)控,降低腫瘤復(fù)發(fā)的可能性,這可以通過(guò)免疫記憶實(shí)現(xiàn)�，F(xiàn)在已有一些腫瘤疫苗上市,可以預(yù)見在將來(lái),人們很有可能能通過(guò)疫苗來(lái)預(yù)防治療腫瘤。腫瘤相關(guān)糖抗原(TACAs)是指在正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞上都存在,但在表達(dá)量上有很大差異的糖抗原,它與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲都有關(guān)系。唾液酸化Lewis x(sialyl Lewis x,sLex)是E、P和L-選擇素這三種粘附分子的配基,多表達(dá)在胚胎組織及腫瘤細(xì)胞表面,在免疫細(xì)胞上也有少量的表達(dá)。研究表明,sLex在一些惡性上皮性腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。所以sLex是一種設(shè)計(jì)腫瘤疫苗的合適靶標(biāo),但是sLex屬于TACAs,而TACAs不能引起T細(xì)胞的免疫應(yīng)答,導(dǎo)致它并不能產(chǎn)生高親和力的IgG抗體,也不能產(chǎn)生記憶細(xì)胞,且容易引起免疫耐受。將TACAs與蛋白載體相連接的方法可以用來(lái)提升免疫原性,使糖抗原可以被T細(xì)胞識(shí)別,引起T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。CRM197蛋白是白喉毒素(diphtheriatoxin,DTx)突變體,它沒有白喉毒素的毒性,但保留了與白喉毒素相同的炎癥性和免疫刺激性,這使它被廣泛應(yīng)用作糖結(jié)合物疫苗載體。鑰孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)來(lái)自于海洋蝸牛的血淋巴,也被廣泛應(yīng)用為載體蛋白,首先對(duì)比其他載體蛋白KLH能引出更強(qiáng)的免疫應(yīng)答,這是由于其相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)大、結(jié)構(gòu)較復(fù)雜造成的,其次由于KLH來(lái)源于海洋蝸牛,它在生物系統(tǒng)上遠(yuǎn)離哺乳動(dòng)物物種,因此在測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生與哺乳動(dòng)物待檢測(cè)靶點(diǎn)樣品發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體的可能性較小。本課題將sLex與重組的CRMI97蛋白或KLH蛋白相連接,合成了CRM197-sLex和KLH-sLex結(jié)合物疫苗,并對(duì)其進(jìn)行了免疫學(xué)評(píng)價(jià)。同時(shí),對(duì)與蛋白載體連接的sLex衍生物——sLex-方酸乙酯的活性進(jìn)行了研究。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下。第一部分1 CRM197蛋白的表達(dá)和純化目的蛋白CRM197在大腸桿菌中除了以包涵體的形式大量表達(dá),也以可溶的形式少量表達(dá)。鑒于實(shí)驗(yàn)用量、純化的簡(jiǎn)便性以及純化蛋白的穩(wěn)定性考慮,主要純化了可溶性表達(dá)的CRM197,在20℃、0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)條件下,每1 L菌液獲得純化的CRM197 7.5 mg。2糖蛋白結(jié)合物疫苗的合成及其合成效率測(cè)定以方酸二乙酯活化sLex,將sLex糖鏈與CRM197蛋白、KLH蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)進(jìn)行偶聯(lián),得到的糖結(jié)合物疫苗用MALDI-TOF-MASS或硫酸一苯酚法進(jìn)行分析。經(jīng)計(jì)算,平均一分子CRM197的載糖率約為4%;平均一分子KLH的載糖率約為7%;平均一分子BSA的載糖率約為3%;平均一分子HSA的載糖率約為10.8%。3糖蛋白結(jié)合物疫苗的免疫學(xué)評(píng)價(jià)將合成的CRM197-sLex和KLH-sLex結(jié)合物作為疫苗對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行四次免疫并取得抗血清,抗血清用直接ELISA法進(jìn)行抗體滴度(IgG)的分析�？贵w滴度分析中,CRM197-sLex結(jié)合物免疫的抗血清可以產(chǎn)生更高的抗體滴度(1:72900),KLH-sLex結(jié)合物免疫的抗血清產(chǎn)生的抗體滴度為1:24300。用MTT法測(cè)定抗血清的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性作用(CDC)。用結(jié)合物疫苗免疫的小鼠產(chǎn)生的抗血清在補(bǔ)體存在的情況下,以劑量依賴型的方式對(duì)人肺癌A549細(xì)胞和鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的殺傷作用,B16-F10細(xì)胞與2 μL抗血清共孵育存活率約為40%,A549細(xì)胞與2 μL抗血清共孵育存活率約為60%。通過(guò)劃?rùn)M實(shí)驗(yàn)測(cè)定抗血清對(duì)腫瘤遷移的影響,在36和48h時(shí)抗血清對(duì)A549細(xì)胞的遷移有顯著的抑制作用。通過(guò)體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 KLH-sLex結(jié)合物對(duì)腫瘤的抑制率和存活率的影響都強(qiáng)于PBS組,但均不如KLH組,猜想有可能是sLexProSQ的體內(nèi)活性對(duì)腫瘤抑制率和小鼠存活率造成了影響。第二部分1 SLexProSQ的細(xì)胞毒性測(cè)定用MTT法測(cè)定不同濃度sLexProSQ對(duì)EA.hy926細(xì)胞、B16-F10細(xì)胞、A549細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的存活率的影響。結(jié)果顯示,sLexProSQ在各個(gè)濃度(0.1、0.2、0.5、1、2、4、6、8、10 μg/mL)以及所有檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)(6、12及24 h)都對(duì)細(xì)胞存活率沒有明顯的影響。2 SLexProSQ抗E-選擇素粘附效應(yīng)用MTT法測(cè)定不同濃度sLexProSQ與B16-F10細(xì)胞、A549細(xì)胞共孵育對(duì)E-選擇素粘附效應(yīng)的影響。結(jié)果顯示,sLexProSQ在800μg/mL的濃度下對(duì)細(xì)胞與選擇素的粘附有顯著的抑制效果。3 SLexProSQ體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究SLexProSQ高中低三個(gè)劑量均對(duì)小鼠B16-F10黑色素瘤有一定的抑制作用,低劑量組抑制率平均為13%、中劑量組抑制率平均為59.7%、高劑量組抑制率平均為27.4%。HE染色觀察組織壞死情況,給藥組壞死均強(qiáng)于PBS組,PBS組腫瘤細(xì)胞的異型性較給藥組更為嚴(yán)重。CD34免疫組化結(jié)果表明給藥組腫瘤組織新血管生成少于PBS組,且中劑量組新血管生成最少。與Western blot做VEGFR-2條帶顯示結(jié)果一致。用ELISA法測(cè)定sLexProSQ不同劑量對(duì)IL-6、TNF-αα和IL-1β含量的影響,隨著給藥劑量的升高IL-6的含量降低,TNF-α和IL-1β的含量升高。結(jié)論和意義本研究成功合成了 CRM197-sLex和KLH-sLex結(jié)合物疫苗,并對(duì)其進(jìn)行了免疫學(xué)評(píng)價(jià)。C57BL/6小鼠可以在結(jié)合物疫苗的刺激下產(chǎn)生較高的抗體滴度,其抗血清在體外有補(bǔ)體存在的情況下可以殺傷表達(dá)該抗原的腫瘤細(xì)胞,并能在體外抑制表達(dá)該抗原的腫瘤遷移,但在體內(nèi)并未產(chǎn)生良好的抗腫瘤效果。通過(guò)對(duì)sLex衍生物的活性進(jìn)行研究,體外研究發(fā)現(xiàn)sLexProSQ具有抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)E-選擇素的粘附,體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)sLexProSQ在一定劑量下對(duì)腫瘤具有明顯的抑制作用。本研究為基于sLex的糖疫苗的設(shè)計(jì)和研究提供了基礎(chǔ),也為sLex及其衍生物作為抗腫瘤制劑的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R96
【圖文】：

瘤免疫方法主要包括特異性主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫及過(guò)繼免疫。逡逑腫瘤的特異性主動(dòng)免疫主要指的是腫瘤疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腫瘤相關(guān)特逡逑異性抗原的免疫應(yīng)答。癌癥特異性免疫的產(chǎn)生需要三個(gè)步驟（圖１－１），一，抗逡逑原遞呈細(xì)胞（例如樹突細(xì)胞［ＤＣｓ］）將癌抗原捕獲并加工成抗原肽，將抗原肽表逡逑達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞表面，從而被相應(yīng)Ｔ細(xì)胞的Ｔ細(xì)胞抗原受體（ＴＣＲ）識(shí)別（信逡逑號(hào)１）。二，Ｔ細(xì)胞活化需要多種細(xì)胞表面配對(duì)協(xié)同刺激分子與Ｔ細(xì)胞和抗原遞逡逑呈細(xì)胞結(jié)合（信號(hào)２）。為了實(shí)現(xiàn)最佳的Ｔ細(xì)胞活化，信號(hào)１和２都是必需的。逡逑三，活化的特異性Ｔ細(xì)胞到達(dá)腫瘤位點(diǎn)并識(shí)別表達(dá)該抗原的腫瘤細(xì)胞，從而殺逡逑死癌細(xì)胞［２］。逡逑１０逡逑

ｓＬｅｘ和相關(guān)表位的表達(dá)的情況。逡逑原發(fā)腫瘤細(xì)胞首先進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，而后形成腫瘤血栓，最后與肝、肺等較遠(yuǎn)逡逑器官的內(nèi)皮細(xì)胞相互作用從而完成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程如圖１－２所示。逡逑邐Ｐｒｉｍａｒｙ邋ｔｕｍｏｒ逡逑Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ邋ｓｅｄｉｍｅｎｔ逡逑１１邋＾逡逑Ｔｒａｎｓｆｅｒｅｅ＂邐？邐Ｂａｓｉｌａｒ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ＾邐Ｎ．邋＾邐Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ逡逑ｐｌａｔｅｌｅｔ邋Ｔｕｍｏｒ邋ｅｍｂｏｌｉ逡逑圖１－２腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｕｍｏｒ邋ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ逡逑１５逡逑

２方法逡逑２．１邋ＳＬｅｘ－方酸乙酯的制備逡逑參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法［３９，４（）］制備。合成過(guò)程如圖２－２。逡逑在ｓＬｅｘ－方酸乙酯合成過(guò)程中是用了化學(xué)合成和酶法合成結(jié)合的方法，最大逡逑限度的簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，減少了原材料的浪費(fèi)。在ｓＬｅｘ－方酸乙酯的合成中，我逡逑們應(yīng)用了邋３種一鍋多酶體系，分別針對(duì)半乳糖（Ｇａｌ）、唾液酸（ＮｅＵ５Ａｃ）以及逡逑巖藻糖（Ｌ－ｆｔｉｃｏｓｅ）邋３種單糖的引入。其中用到的幾種酶分別是５私ｆｏＺｗｃｆｅｒｆｗｗ逡逑／ｏｗｇｗｍ來(lái)源的ＵＤＰ糖焦a愃嶧福ǎ攏蹋眨櫻校�？ＥｓｃＡｅ}悖輳媯歟悖錚叢吹哪蜍斬愬義纖崞咸且旃姑福ǎ牽幔戾澹耍�、ｍｅｖ崸ｖ嵓傯ｅP媯錮叢吹內(nèi)啵保矗肴樘腔潑稿義希ǎ危恚蹋紓簦攏⒗叢吹膩澹茫停繡逋僖核嶠筧愃嶧福ǎ危恚茫櫻櫻㈠義�？ＰｅP螅簦錚潁澹媯戾澹恚鰨簦錚悖祝徨澹恚鰨瘢鰨悖ⅲВ錚浚幔謇叢吹膩澹幔玻常僖核嶙潑福ǎ校恚櫻裕椋停保矗矗模�、辶x匣В幔紓簦錮叢吹哪裎舳愃嵫以逄墻筧愃嶧福ǎ疲耍校ⅲ罰澹媯悖錚冢荊媯歟茫簦澹潁咤義希穡擼錚潁胬叢吹模幔歟常以逄親潑福ǎ齲穡幔歟常疲酰悖裕�。辶x弦隕瞎丶付際搶沒蛑刈榧際踅卸ㄏ蚋腦旌蟮拿�，改X旌蟮拿婦哂腥玨義舷掠攀疲壕竅婦叢吹拿福芄輝詮菇ǖ墓こ嘆懈咝П澩錚�，催化活性笖]苠義細(xì)呤章實(shí)慕泄煙嗆銑桑壞孜鍤視π鑰�，纳愐暒釉嶗种天然及仿N烊壞墓煙嗆銑桑誨義隙緣孜鎘醒細(xì)竦目占溲≡裥浴⑶蜓≡裥�，无需窂摩前对窂摩物进兄x瘧；ぃ誨義戲從χ屑負(fù)趺揮懈輩锏納

本文編號(hào)：2776362