【摘要】：阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease,AD)又被稱為老年癡呆,是一種隱匿、持續(xù)發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病。AD主要在老年人中發(fā)病,病情惡化程度隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重,病人會(huì)逐步喪失全部記憶、自理能力和行動(dòng)能力,最終走向死亡。目前,AD已經(jīng)成為威脅全世界65歲以上老年人生命的第五類致死性疾病。因此,對(duì)于AD的研究及抗AD的藥物的開(kāi)發(fā)是十分必要且緊迫的。對(duì)于AD具體的發(fā)病原因和機(jī)制至今尚不明確,其中以淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)機(jī)制和氧化損傷機(jī)制最為廣泛被學(xué)者認(rèn)可。Aβ的產(chǎn)生和清除失衡導(dǎo)致過(guò)其多在腦組織中聚集和沉積,而Aβ的大量產(chǎn)生、異常聚集和神經(jīng)細(xì)胞外沉積會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性,這種毒性可以使大腦皮層內(nèi)發(fā)生復(fù)雜的級(jí)聯(lián)變化,如突觸喪失、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、氧化壓力、胞內(nèi)離子通道破壞、PHF并最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷死亡,最終引發(fā)AD。目前對(duì)于單一靶點(diǎn)抗AD的藥物研究進(jìn)展并不理想,多靶點(diǎn)藥物的開(kāi)發(fā)成為抗AD的熱點(diǎn)研究方向。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)研究中根據(jù)抗壞血酸過(guò)氧化物酶的主體結(jié)構(gòu)、微過(guò)氧化物酶MP-9的結(jié)構(gòu)、以亞血紅素為靶分子篩選噬菌體展示肽庫(kù)所得到的序列,設(shè)計(jì)了一種含His的過(guò)氧化物酶模擬酶次血紅素六肽(Deuterohemin-AlaHisThrValGluLys,DhHP-6),具有較高的過(guò)氧化物酶活力,在體內(nèi)具有清除自由基、抗氧化的作用。文獻(xiàn)報(bào)道iAβ5p(LPFFD)是經(jīng)過(guò)改造的β片層斷裂肽(BSBp),能夠結(jié)合到Aβ_(1-42)的核心疏水區(qū)域進(jìn)而破壞β-片層結(jié)構(gòu)的形成,從而阻止Aβ_(1-42)聚集。因此,本論文擬通過(guò)抑制Aβ_(1-42)聚集和抗氧化應(yīng)激兩個(gè)靶點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)合成一條具有擬過(guò)氧化物酶-抑制Aβ_(1-42)聚集的雙功能肽(BP,Dh-βAlaHisThrValGluLysLeuProPhe Phe Asp),即以共價(jià)連接的形式將β片層斷裂肽iAβ5p連接在過(guò)氧化物酶DhHP-6上。利用固相肽合成法合成BP后,通過(guò)在體外測(cè)定其過(guò)氧化物酶活力,清除自由基能力;在蛋白水平檢測(cè)其與Aβ_(1-42)相互作用,構(gòu)建并利用AD細(xì)胞模型SH-SY5Y細(xì)胞測(cè)定其在體外抗AD作用效果,并以過(guò)表達(dá)人源Aβ_(1-42)突變體秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans,C.elegans)CL4176線蟲作為動(dòng)物模型,測(cè)定對(duì)線蟲壽命和癱瘓率的影響,并通過(guò)Aβ_(1-42)斑塊沉積、ROS含量以及Aβ_(1-42)和hspmRNA表達(dá)水平探究其抗AD的作用機(jī)制。本論文首先通過(guò)Fmoc固相肽合成法合成BP,經(jīng)MALDI-TOF-MS確定相對(duì)分子質(zhì)量為1848,確認(rèn)為目標(biāo)產(chǎn)物,通過(guò)HPLC制備BP純品0.997g,收率為53.95%;通過(guò)維生素C和H_2O_2雙底物法測(cè)定BP酶活力為20.8U/mg,為DhHP-6的38.3%,并通過(guò)DPPH自由基清除法,證明BP具有抗氧化的作用,0.9μM BP即可達(dá)到50%DPPH清除率;通過(guò)生物大分子相互作用系統(tǒng)(BLI)證明BP具有與Aβ_(1-42)親和作用,KD值為9.07,并通過(guò)Tris-Tricine-SDS實(shí)驗(yàn)和ThT熒光染色實(shí)驗(yàn),證明BP在體外具有抑制Aβ_(1-42)聚集成寡聚體和β淀粉樣蛋白成熟體即β片層纖維的作用;利用40μM Aβ_(25-35)在37℃溫育24h后誘導(dǎo)細(xì)胞損傷,細(xì)胞存活率為67.73%,成功建立阿爾茲海默癥細(xì)胞模型,并通過(guò)MTT法證明,BP在體外細(xì)胞模型中具有Aβ_(1-42)損傷保護(hù)作用,15μMBP實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率達(dá)到85.13%;通過(guò)AD模型突變體線蟲CL4176,證明BP能夠延緩由Aβ_(1-42)表達(dá)產(chǎn)生而引起的線蟲癱瘓和死亡,其抗Aβ_(1-42)損傷作用是通過(guò)減少抑制Aβ_(1-42)聚集形成的斑塊沉積和抗氧化清除ROS的方式,同時(shí)上調(diào)分子伴侶hsp16.2、hsp16.41和hsp12.6表達(dá)幫助Aβ_(1-42)正確折疊。綜上所述,BP具有抗氧化作用,能夠提高抵抗Aβ_(1-42)誘導(dǎo)的氧化損傷能力;又具有β片層斷裂肽作用,能夠阻止Aβ_(1-42)的產(chǎn)生和聚集,使Aβ_(1-42)正確折疊來(lái)減少Aβ_(1-42)斑塊沉積,防止其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的進(jìn)一步損傷,雙靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮抗AD的作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R914;R96
【圖文】：

[10]，該病已經(jīng)成為威脅全世界 65 歲以上老年人生因此，AD 的研究和治療已經(jīng)迫在眉睫，同時(shí)抗 A和開(kāi)發(fā)是十分必要且緊迫的。理特征神經(jīng)病理學(xué)特征病理?yè)p傷主要集中在大腦皮質(zhì)和某些皮層下區(qū)域。、溝回增寬、腦室擴(kuò)大，其中顳葉、頂葉以及額層下區(qū)域會(huì)出現(xiàn)廣泛的神經(jīng)元和突觸的丟失、損著類似的變性[13]。同時(shí)，通過(guò)核磁共振和 PET-C從輕度認(rèn)知功能障礙到最終發(fā)病的過(guò)程中，AD 域體積縮小的特點(diǎn)[15]。

圖 1.2 健康人與 AD 患者的神經(jīng)細(xì)胞D 作用機(jī)制假說(shuō) AD 具體的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，但能夠確定有 1%~5%的有關(guān)[21]�；趯�(duì) AD 的多年研究，目前形成五種被廣泛認(rèn)可別是 β-淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)機(jī)制，氧化應(yīng)激損傷學(xué)說(shuō)，膽堿微管 Tau 蛋白異常學(xué)說(shuō)和早老基因突變學(xué)說(shuō)。其中影響力最文主要依據(jù)的假說(shuō)為淀粉級(jí)聯(lián)假說(shuō)（Amyloid cascade hypothe 淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)機(jī)制假說(shuō)樣蛋白（β-Amyloid，Aβ）于 1984 年由 Glenner 和 Wong 確定 Aβ 是由 39～43 個(gè)氨基酸所組成的具有折疊構(gòu)型的多肽

第一章 前言Aβ 是 APP 經(jīng)由β蛋白水解酶和 γ 蛋白水解酶依次水片段，在人體內(nèi)主要包括 Aβ1-40和 Aβ1-42兩種形式[24]。其始物質(zhì)和主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，在人體內(nèi)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有明顯眾認(rèn)為是 AD 早期觸發(fā)因素[25]。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 段磊;司繼剛;劉萍;;阿爾茨海默病藥物治療研究進(jìn)展[J];河北醫(yī)藥;2015年07期

2 沈怡君;;Aβ蛋白在阿爾茲海默病中的損傷機(jī)制以及研究進(jìn)展[J];中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志;2015年01期

3 ;Copper ions influence the toxicity of β-amyloid(1-42) in a concen-tration-dependent manner in a Caenorhabditis elegans model of Alzheimer’s disease[J];Science China(Life Sciences);2011年06期

4 劉鵬;趙玉芬;李艷梅;;Tau蛋白介導(dǎo)阿爾茲海默病的機(jī)理及相關(guān)藥物[J];中國(guó)科學(xué):化學(xué);2010年07期

5 王麗萍,劉亞麗,楊卉,李惟;一個(gè)新的過(guò)氧化物酶模擬物的合成及抗白內(nèi)障活性研究[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào);2004年11期

6 劉亞麗,郭莉莉,RogerRoeske,羅貴民,李惟;亞血紅素的合成和純化方法的改進(jìn)[J];吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào);2001年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 劉靜;淀粉樣多肽Aβ聚集抑制劑的設(shè)計(jì)、有效性及作用機(jī)理研究[D];南開(kāi)大學(xué);2014年

2 朱曉蕾;氧化應(yīng)激在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中的作用及其靶點(diǎn)藥物的開(kāi)發(fā)[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2012年

3 盛柏楊;APP的異常剪切導(dǎo)致神經(jīng)損傷的機(jī)理研究[D];清華大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 胡冰;次血紅素短肽化合物體外穩(wěn)定性研究[D];吉林大學(xué);2014年

2 趙曉明;過(guò)氧化物酶肽類模擬物的設(shè)計(jì)、合成及酶學(xué)性質(zhì)表征[D];吉林大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2773435