【摘要】：(R)-3-奎寧醇是合成瑞伐托酯、阿地溴銨和索利那新等手性藥物的重要中間體。生物催化法因具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)而被用于(R)-3-奎寧醇的合成。常規(guī)酶偶聯(lián)方法催化不對(duì)稱合成(R)-3-奎寧醇時(shí),羰基還原和輔酶再生過程分別在不同的菌體中進(jìn)行,底物、產(chǎn)物和輔酶須在細(xì)胞間、細(xì)胞內(nèi)外進(jìn)行交換/擴(kuò)散,導(dǎo)致生物轉(zhuǎn)化時(shí)間延長(zhǎng),效率低,不利于工業(yè)化。針對(duì)酶偶聯(lián)方法的缺陷,本課題擬用基因重組和蛋白質(zhì)工程技術(shù)構(gòu)建一種具有雙活性中心、雙功能的融合體酶,實(shí)現(xiàn)羰基不對(duì)稱還原和輔酶原位再生同時(shí)進(jìn)行,繼而循環(huán)使用,以提高生物轉(zhuǎn)化效率。利用親和固定化技術(shù),構(gòu)建一種高效、可循環(huán)再利用的磁性雙功能生物催化劑,建立高效生物催化不對(duì)稱合成(R)-3-奎寧醇的綠色新工藝。具體內(nèi)容如下:1.構(gòu)建雙功能融合酶表達(dá)載體及誘導(dǎo)目標(biāo)酶表達(dá)。通過基因重組技術(shù)將編碼羰基還原酶(Ml QR)和輔酶再生酶(GDH)的兩個(gè)全長(zhǎng)基因序列通過柔性連接子連接,全合成編碼具有羰基還原和輔酶再生的雙功能融合酶(MLG)的全長(zhǎng)基因片段。再將mlg基因片段連接到載體pET28a,形成重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-mlg。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,優(yōu)化的酶表達(dá)條件:16℃、0.2 mM IPTG、誘導(dǎo)表達(dá)36 h,能可溶性高表達(dá)高活性的雙功能融合酶(MLG)。MS確證MLG的氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中氨基酸序列匹配良好。MLG中羰基還原活性為3678U/g,輔酶再生活性為5070 U/g。MLG動(dòng)力學(xué)分析顯示:對(duì)底物3-奎寧酮的K_m值為12.06 mM,K_(cat)/K_m為0.39;對(duì)底物葡萄糖的K_m值為1.62 mM,K_(cat)/K_m為6.08。2.重組全細(xì)胞催化不對(duì)稱合成(R)-3-奎寧醇。優(yōu)化的生物轉(zhuǎn)化條件為:30℃、pH 7-8、0.2 mM輔酶、葡萄糖(1.5倍底物當(dāng)量)、底物/重組細(xì)胞質(zhì)量比為24:1。當(dāng)?shù)孜?-奎寧酮載量為486 g L~(-1)時(shí),生物轉(zhuǎn)化時(shí)間為5.5 h,GC測(cè)定轉(zhuǎn)化率為100%,收率90%,ee值100%,時(shí)空產(chǎn)率1505.5 g L~-11 d~(-1)。3.可循環(huán)磁性雙功能生物催化劑的構(gòu)建。利用共沉淀法合成磁性Fe_3O_4納米粒,通過硅烷將螯合劑NTA偶聯(lián)到磁性納米粒表面,經(jīng)Ni~(2+)功能化形成親和納米磁珠。基于Ni~(2+)親和作用固定組氨酸標(biāo)記的雙功能融合酶,形成可循環(huán)再利用的磁性雙功能生物催化劑。借助馬爾文粒度儀、SEM、紅外光譜儀、熱重分析儀、X-衍射儀、磁性能分析儀等手段表征磁性雙功能生物催化劑。粒徑約20-40 nm;飽和磁化強(qiáng)度為38.96 emu/g,為超順磁性。磁性雙功能生物催化劑中羰基還原(MlQR)活性為2866 U/g,輔酶再生(GDH)活力為6195 U/g。磁性雙功能生物催化劑的酶載量為70.6 mg/g,其中羰基還原和輔酶再生酶活性回收率分別為77.99%、122.18%。4.磁性雙功能生物催化劑在合成(R)-3-奎寧醇中的應(yīng)用。優(yōu)化的生物轉(zhuǎn)化條件為:30℃,pH 8.0左右,輔酶0.2 mM,葡萄糖(底物的1.5倍摩爾當(dāng)量)、生物催化劑與底物質(zhì)量比為1:70,生物轉(zhuǎn)化時(shí)間為5.5 h,GC測(cè)定轉(zhuǎn)化率為100%,產(chǎn)率90%,ee值100%。按生物催化劑與底物質(zhì)量比1:40啟動(dòng)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng),磁性雙功能生物催化劑可循環(huán)使用11次,每克磁性催化劑可獲得產(chǎn)物的相對(duì)產(chǎn)量達(dá)到312.37g。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R914
【圖文】：

用于手性醇的合成前言對(duì)稱氫化還原潛手性酮是制備手性仲醇最直接、最有效方法之一[1]。手種重要的手性砌塊，是各種手性藥物、香料、農(nóng)用化學(xué)品、天然產(chǎn)品的單元[2-5]。(R)-3-奎寧醇(圖 1a)是合成臨床上許多重要手性藥物的關(guān)鍵性如治療慢性阻塞性肺疾病的阿地溴銨(圖 1b)和瑞伐托酯[6](圖 1c)、改善癥引發(fā)的尿頻、尿急和尿失禁癥的索利那新[7](圖 1d)、治療阿爾茨海默利定(圖 1e)[8]和乙酰膽堿酯酶抑制劑(圖 1f 和 g)。

圖 2. 酶偶聯(lián)催化不對(duì)稱還原合成(R)-3-奎寧醇tric reduction synthesis of (R)-3-quinuclidinol by enzyme-coup第二個(gè)酶和提高反應(yīng)催化效率，可采用基因工程技術(shù)通過連接子連接，構(gòu)建一種具有雙活性中心的單鏈多還原與輔酶再生同時(shí)進(jìn)行的設(shè)想(圖 3)。如 Iturrate 等ase/激酶融合酶，該酶具有較好的生物催化活性，與原 倍。Daniel 等[24]將拜耳-維利格單氧酶與亞磷酸脫氫酶能酶實(shí)現(xiàn)了輔助因子高效再生。

圖 2. 酶偶聯(lián)催化不對(duì)稱還原合成(R)-3-奎寧醇tric reduction synthesis of (R)-3-quinuclidinol by enzyme-coup第二個(gè)酶和提高反應(yīng)催化效率，可采用基因工程技術(shù)通過連接子連接，構(gòu)建一種具有雙活性中心的單鏈多還原與輔酶再生同時(shí)進(jìn)行的設(shè)想(圖 3)。如 Iturrate 等ase/激酶融合酶，該酶具有較好的生物催化活性，與原 倍。Daniel 等[24]將拜耳-維利格單氧酶與亞磷酸脫氫酶能酶實(shí)現(xiàn)了輔助因子高效再生。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 萬紅貴;趙宗松;蔣導(dǎo)航;袁建鋒;吳啟賜;;微生物全細(xì)胞催化技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年04期

本文編號(hào)：2772088