【摘要】：(R)-3-奎寧醇是合成瑞伐托酯、阿地溴銨和索利那新等手性藥物的重要中間體。生物催化法因具有反應條件溫和、環(huán)境友好、選擇性高等優(yōu)點而被用于(R)-3-奎寧醇的合成。常規(guī)酶偶聯(lián)方法催化不對稱合成(R)-3-奎寧醇時,羰基還原和輔酶再生過程分別在不同的菌體中進行,底物、產(chǎn)物和輔酶須在細胞間、細胞內(nèi)外進行交換/擴散,導致生物轉化時間延長,效率低,不利于工業(yè)化。針對酶偶聯(lián)方法的缺陷,本課題擬用基因重組和蛋白質工程技術構建一種具有雙活性中心、雙功能的融合體酶,實現(xiàn)羰基不對稱還原和輔酶原位再生同時進行,繼而循環(huán)使用,以提高生物轉化效率。利用親和固定化技術,構建一種高效、可循環(huán)再利用的磁性雙功能生物催化劑,建立高效生物催化不對稱合成(R)-3-奎寧醇的綠色新工藝。具體內(nèi)容如下:1.構建雙功能融合酶表達載體及誘導目標酶表達。通過基因重組技術將編碼羰基還原酶(Ml QR)和輔酶再生酶(GDH)的兩個全長基因序列通過柔性連接子連接,全合成編碼具有羰基還原和輔酶再生的雙功能融合酶(MLG)的全長基因片段。再將mlg基因片段連接到載體pET28a,形成重組表達質粒pET28a-mlg。質粒轉化感受態(tài)細胞,優(yōu)化的酶表達條件:16℃、0.2 mM IPTG、誘導表達36 h,能可溶性高表達高活性的雙功能融合酶(MLG)。MS確證MLG的氨基酸序列與蛋白質數(shù)據(jù)庫中氨基酸序列匹配良好。MLG中羰基還原活性為3678U/g,輔酶再生活性為5070 U/g。MLG動力學分析顯示:對底物3-奎寧酮的K_m值為12.06 mM,K_(cat)/K_m為0.39;對底物葡萄糖的K_m值為1.62 mM,K_(cat)/K_m為6.08。2.重組全細胞催化不對稱合成(R)-3-奎寧醇。優(yōu)化的生物轉化條件為:30℃、pH 7-8、0.2 mM輔酶、葡萄糖(1.5倍底物當量)、底物/重組細胞質量比為24:1。當?shù)孜?-奎寧酮載量為486 g L~(-1)時,生物轉化時間為5.5 h,GC測定轉化率為100%,收率90%,ee值100%,時空產(chǎn)率1505.5 g L~-11 d~(-1)。3.可循環(huán)磁性雙功能生物催化劑的構建。利用共沉淀法合成磁性Fe_3O_4納米粒,通過硅烷將螯合劑NTA偶聯(lián)到磁性納米粒表面,經(jīng)Ni~(2+)功能化形成親和納米磁珠�；贜i~(2+)親和作用固定組氨酸標記的雙功能融合酶,形成可循環(huán)再利用的磁性雙功能生物催化劑。借助馬爾文粒度儀、SEM、紅外光譜儀、熱重分析儀、X-衍射儀、磁性能分析儀等手段表征磁性雙功能生物催化劑。粒徑約20-40 nm;飽和磁化強度為38.96 emu/g,為超順磁性。磁性雙功能生物催化劑中羰基還原(MlQR)活性為2866 U/g,輔酶再生(GDH)活力為6195 U/g。磁性雙功能生物催化劑的酶載量為70.6 mg/g,其中羰基還原和輔酶再生酶活性回收率分別為77.99%、122.18%。4.磁性雙功能生物催化劑在合成(R)-3-奎寧醇中的應用。優(yōu)化的生物轉化條件為:30℃,pH 8.0左右,輔酶0.2 mM,葡萄糖(底物的1.5倍摩爾當量)、生物催化劑與底物質量比為1:70,生物轉化時間為5.5 h,GC測定轉化率為100%,產(chǎn)率90%,ee值100%。按生物催化劑與底物質量比1:40啟動生物轉化反應,磁性雙功能生物催化劑可循環(huán)使用11次,每克磁性催化劑可獲得產(chǎn)物的相對產(chǎn)量達到312.37g。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914
【圖文】：

用于手性醇的合成前言對稱氫化還原潛手性酮是制備手性仲醇最直接、最有效方法之一[1]。手種重要的手性砌塊，是各種手性藥物、香料、農(nóng)用化學品、天然產(chǎn)品的單元[2-5]。(R)-3-奎寧醇(圖 1a)是合成臨床上許多重要手性藥物的關鍵性如治療慢性阻塞性肺疾病的阿地溴銨(圖 1b)和瑞伐托酯[6](圖 1c)、改善癥引發(fā)的尿頻、尿急和尿失禁癥的索利那新[7](圖 1d)、治療阿爾茨海默利定(圖 1e)[8]和乙酰膽堿酯酶抑制劑(圖 1f 和 g)。

圖 2. 酶偶聯(lián)催化不對稱還原合成(R)-3-奎寧醇tric reduction synthesis of (R)-3-quinuclidinol by enzyme-coup第二個酶和提高反應催化效率，可采用基因工程技術通過連接子連接，構建一種具有雙活性中心的單鏈多還原與輔酶再生同時進行的設想(圖 3)。如 Iturrate 等ase/激酶融合酶，該酶具有較好的生物催化活性，與原 倍。Daniel 等[24]將拜耳-維利格單氧酶與亞磷酸脫氫酶能酶實現(xiàn)了輔助因子高效再生。

圖 2. 酶偶聯(lián)催化不對稱還原合成(R)-3-奎寧醇tric reduction synthesis of (R)-3-quinuclidinol by enzyme-coup第二個酶和提高反應催化效率，可采用基因工程技術通過連接子連接，構建一種具有雙活性中心的單鏈多還原與輔酶再生同時進行的設想(圖 3)。如 Iturrate 等ase/激酶融合酶，該酶具有較好的生物催化活性，與原 倍。Daniel 等[24]將拜耳-維利格單氧酶與亞磷酸脫氫酶能酶實現(xiàn)了輔助因子高效再生。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 萬紅貴;趙宗松;蔣導航;袁建鋒;吳啟賜;;微生物全細胞催化技術在工業(yè)生產(chǎn)中的應用[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2011年04期

本文編號：2772088