【摘要】：隨著手性藥物的市場需求急劇增長,手性藥物及其中間體的制備越來越受到人們的關注。S-3-環(huán)己烯-1-甲酸是抗凝血藥依度沙班的手性前體物質(zhì),因此制備光學純的S-3-環(huán)己烯-1-甲酸具有重要意義。目前其生產(chǎn)方式為化學法手性拆分,但存在操作步驟繁瑣且過程中要用到有毒的丙酮試劑等缺點。如能開發(fā)可代替化學法的簡單高效且綠色環(huán)保的生物催化途徑,將有助于抗凝血藥依度沙班的可持續(xù)生產(chǎn)。酯酶BioH是一種能夠催化酯鍵水解的酶,可以不對稱水解外消旋3-環(huán)己烯-1-甲酸甲酯,得到3-環(huán)己烯-1-甲酸。但是野生型酯酶BioH對S-3-環(huán)己烯-1-甲酸甲酯的選擇性不高(ee_p=32.32%),造成目標產(chǎn)物的合成效率和光學純度均不理想,因此本論文以S-3-環(huán)己烯-1-甲酸的生物催化法制備為目標,通過對酯酶BioH進行分子改造來提高其S-選擇性。本文利用計算模擬作為輔助工具,通過分子對接的手段,結合酶蛋白-底物的對接構象對酯酶BioH進行了理性設計,通過調(diào)整活性口袋的空間位阻作用、酶和底物間的芳香環(huán)作用以及氫鍵作用來調(diào)整其對映體選擇性,并在此基礎上對最終獲得的陽性突變體和野生型酯酶BioH進行了分子動力學模擬,對選擇性提高的機理進行了探討。本文具體的研究內(nèi)容和實驗結果如下:(1)基于對酯酶BioH的結構與催化機理的充分了解,把酯酶BioH與底物進行分子對接,根據(jù)兩種構型的對映異構體底物與酶對接構象的差異,制定理性設計的策略,構建了9個單點突變,其中有6個為對S-3-環(huán)己烯-1-甲酸甲酯選擇性提高的陽性突變體,進一步通過組合突變獲得最優(yōu)突變體Mu3(L24A/W81A/L209A),其ee_p值達到了70.92%。(2)可溶性表達分析發(fā)現(xiàn),上述突變體均有包涵體表達的情況,特別是Mu3只有微量的可溶性表達,無法達到反應所需的酶濃度。因此,對突變體的誘導表達條件進行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)IPTG濃度為0.1 mM、16℃、TB培養(yǎng)基誘導24 h時,可溶性表達效果最佳。(3)為了提高Mu3對底物的催化效率,分別考察了溫度、pH、助溶劑種類和濃度對催化反應的影響,最終確定最適溫度為30oC、最佳pH為8.0,最適助溶劑為2.5%(v/v)的吐溫80,反應條件優(yōu)化后,Mu3的催化活性達到未優(yōu)化前的2倍左右。(4)通過對野生型酯酶BioH和優(yōu)勢突變體Mu3進行分子動力學模擬分析,分別從結合能和構象的角度分析了Mu3選擇性提高的原因。發(fā)現(xiàn)Mu3對R-底物和S-底物的結合能差異高于WT(野生型BioH),因此Mu3對S-底物的選擇性提高。但是Mu3對R-底物和S-底物的結合能均高于WT,并且突變后過大的活性口袋不利于底物的結合,因此,Mu3酶活低于WT。
【學位授予單位】：浙江工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914
【圖文】：

構體（Diastereoisomers）。非對映異構體和對映異構體不同，非對映異構體的化學性質(zhì)雖然相似，但在物理性質(zhì)上會呈現(xiàn)出一定的差異。圖1-1 手性[1]Figure 1-1. Chirality

浙江工業(yè)大學碩士學位論文6圖1-2 酯酶BioH的催化機理Figure 1-2. Catalytic mechanism of esterase BioH1.3 3-環(huán)己烯-1-甲酸1.3.1 S-3-環(huán)己烯-1-甲酸的簡介S-3-環(huán)己烯-1-甲酸是凝血因子 Xa 抑制劑依度沙班（edoxaban，商品名：Savaysa）的重要起始原料。依度沙班是日本第一三共株式會社研發(fā)的小分子口服抗凝藥，其相對分子質(zhì)量為 738.27，化學結構式見圖 1-3[29]。2014 年，加拿大心房顫動管理指南推薦 Edoxaban 用于非瓣膜性心房顫動患者的抗凝治療[30]。與用于預防心房顫動患者中風和全身性血栓形成的一線抗凝藥物華法林（Warfarin）相比，依度沙班的治療效果與之相當，但總出血事件和心血管死亡的發(fā)生率較低，它未來的應用前景會很好。與同類型凝血因子 Xa 抑制劑藥物，如阿哌沙班、利伐沙班比較（表 1-1）[31]

睦硇隕杓萍安歡猿撲釘?3-環(huán)己烯-1-甲酸甲酯工藝優(yōu)化7圖1-3 依度沙班的化學結構式[29]Figure 1-1. Chemical structure of Edoxaban表1-1 抗凝血藥的藥理學參數(shù)[31]Table 1-1. Pharmacological characteristics of anticoagulants信息 利伐沙班 阿哌沙班 依度沙班上市時間及地點 2009 年中國 2013 年中國 2011 年日本手性碳原子 有 無 有作用靶點 凝血因子 Xa 凝血因子 Xa 凝血因子 Xa給藥方式 口服 口服 口服T1/2（h） 10-14 9-12 6-11生物利用度 50-55 60-86 67代謝途徑 66.6%腎臟 25.0%腎臟 35.0%腎臟禁忌 避免與 P-pg 和CYP3A4 的抑制劑聯(lián)用避免與 P-pg 和CYP3A4 的抑制劑聯(lián)用未發(fā)現(xiàn)1.3.2 S-3-環(huán)己烯-1-甲酸的制備目前，通過使用非對映異構體拆分方法可以有效得到 S-3-環(huán)己烯-1-甲酸[32]，如圖 1-4。以手性苯乙胺作為手性拆分劑，得到外消旋 3-環(huán)己烯-1-甲酸與苯乙胺形成的非對映體異構體，基于這對非對映體異構體在丙酮中溶解度的差異來進行分離。緩慢冷卻重結晶 6 次后，最終 R-3-環(huán)己烯-1-甲酸的得率為 28.3%，S-3-環(huán)己烯-1-甲酸的得率為 28.7%，兩者的光學純度均大于 99%

【參考文獻】

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本文編號：2771210