【摘要】：背景癌癥嚴(yán)重危害人類健康,目前仍然是一個難以攻克的醫(yī)學(xué)難關(guān)。臨床上用于癌癥治療的方法主要有手術(shù)治療,化學(xué)療法和放射療法等。其中,化學(xué)療法依然是主流的首選方法,也是放射療法與手術(shù)治療的協(xié)同方法。經(jīng)典的化學(xué)療法通常采用小分子化學(xué)藥物干擾細(xì)胞分裂過程,以促進腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死。盡管這些細(xì)胞毒性藥物作為臨床一線抗癌藥物已經(jīng)取得了良好的療效,但其也存在一些缺陷,例如靶向性差,生物利用度低,毒副作用大,以及易促使癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性等。為減少這些弊端,聯(lián)合應(yīng)用兩種或多種藥理機制不同或毒副作用不同的抗癌藥物用于癌癥的治療的方案,即聯(lián)合化療(combination chemotherapy)應(yīng)運而生。目前,聯(lián)合化療已成為許多癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。隨著納米技術(shù)在制藥領(lǐng)域的發(fā)展,基于聯(lián)合化療的理念,將至少兩種具有理化性質(zhì)不同和藥理機制相異的抗癌藥物加載到同一納米藥物遞送系統(tǒng)(NDDS)中,稱為納米藥物聯(lián)合遞送系統(tǒng)(NDCDS)。與使用兩種游離藥物的聯(lián)合化療相比,NDCDS在突破生物屏障、高靶向性、增強在癌組織的滲透能力以及控制藥物釋放等方面具有優(yōu)勢,能更好地使化療藥物產(chǎn)生協(xié)同作用。近年來,大多數(shù)NDCDS僅將兩種或多種藥物加載到同一種納米粒中,可被稱為藥物聯(lián)合遞送單納米顆粒(single nanoparticles for drug co-delivery,SNDCD)。其優(yōu)點為:顯著提高模式藥物在腫瘤區(qū)域的積累,產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)以提高抗腫瘤效果。但也有不足之處,如被荷載的兩種藥物,由于其理化性質(zhì)不同,通常載藥率與包封率不同,因而在遞藥時無法準(zhǔn)確定量各類藥物的劑量;其次,荷載在同一物理空間,SNDCD在儲藏或遞藥時可能導(dǎo)致藥物相互之間發(fā)生物理或化學(xué)作用,最終可能影響療效。惡性腫瘤是復(fù)雜的組織,不僅包括癌細(xì)胞,還包括基質(zhì)細(xì)胞,如內(nèi)皮細(xì)胞,成纖維細(xì)胞和許多免疫細(xì)胞,以及它們產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)。這種由腫瘤細(xì)胞,基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)所構(gòu)成的集合體,被稱為腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)。越來越多的研究表明TME在腫瘤的發(fā)生和遷移中起著重要作用。以TME中的關(guān)鍵細(xì)胞為藥物作用靶點可用于腫瘤的治療。實驗?zāi)康幕赥ME、聯(lián)合化療的理論,并與當(dāng)代納米遞藥技術(shù)相結(jié)合,我們提出將抗癌藥物長春新堿(VCR)與抗纖維化藥物吡非尼酮(PFD)分別荷載在不同的納米顆粒中(CPNP_(VCR)和PPNP_(PFD)),期望這種聯(lián)合遞送策略可提高抗癌效果的科研假設(shè)。創(chuàng)新性地設(shè)計與制備用于遞送靶向TME中癌細(xì)胞與癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)的小分子藥物的二元混合藥物聯(lián)合遞送納米顆粒(Binary blended nanoparticles for drug co-delivery,BBN-DCD),并對其理化表征、生物效應(yīng)與機理進行了探討。實驗方法1.制備與表征我們采用乳化-溶劑揮發(fā)法成功制備了CPNP、CPNP_(VCR)和CPNP_(Rh123),采用薄膜分散法成功制備了PPNP、PPNP_(PFD)和PPNP_(C6)。同時對所制備的納米粒進行了物理化學(xué)表征的檢測。通過透射電子顯微鏡觀察了納米粒的表面形態(tài)和分散情況。通過激光共聚焦顯微鏡觀察了可熒光示蹤的納米粒CPNP_(Rh123)和PPNP_(C6)的混懸液,以評估兩種納米�；旌虾蟮木奂闆r。采用ZetaPALS高分辨電位及粒度分析儀對納米顆粒的粒徑和表面電荷進行了檢測。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和X衍射(X-RD)檢測游離藥是否被成功包載進納米顆粒中。使用UV-Vis分光光度計檢測了納米顆粒的包載率和載藥率,以及體外pH敏感性釋放的情況。2.體外細(xì)胞培養(yǎng)和NIH/3T3的誘導(dǎo)活化我們選用的模式細(xì)胞為人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH/3T3)。為了獲得癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs),我們在體外用轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1對NIH/3T3進行誘導(dǎo)活化,并用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測了CAFs細(xì)胞的標(biāo)記蛋白,α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和成纖維活化蛋白(FAP)的表達量,以評估NIH/3T3細(xì)胞是否被成功活化為CAFs細(xì)胞。3.體外細(xì)胞毒性實驗利用WST-1的方法評估了納米材料的細(xì)胞毒性,并檢測了游離藥和納米藥對A549和CAFs細(xì)胞的細(xì)胞毒性,分別計算了半抑制濃度(IC_(50))和協(xié)同指數(shù)(CI_(50)),以評估我們的納米共遞藥系統(tǒng)抗腫瘤細(xì)胞增殖的協(xié)同作用。4.生物效應(yīng)和機理研究在生物效應(yīng)的研究中,我們建立了A549和CAFs細(xì)胞的非接觸性體外共培養(yǎng)模型,對該共培養(yǎng)模型進行不同的給藥方式處理48 h后,觀察A549的增殖情況,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測了A549的凋亡情況,以此評估CAFs對A549的增殖或凋亡的鄰近效應(yīng)。此外,我們還通過蛋白免疫印跡法(Western blot)評估了PFD對CAFs的逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果1.納米顆粒的物理化學(xué)表征我們制備的幾種納米顆粒粒徑均在100-200 nm,粒徑均一且分散性良好。由于納米粒的表面均帶負(fù)電荷,將CPNP_(VCR)和PPNP_(PFD)的水溶液混合后,納米粒也未發(fā)生聚集現(xiàn)象。傅里葉紅外和X衍射結(jié)果顯示,游離藥均已成功載入納米粒中。UV-Vis分光光度計檢測到兩載藥納米粒均具有較高的包封率和載藥率,能夠滿足本研究后續(xù)實驗的需求。此外,體外藥學(xué)釋放實驗中,納米粒CPNP_(VCR)和PPNP_(PFD)能夠響應(yīng)不同的pH,實現(xiàn)藥物的控釋。2.NIH/3T3細(xì)胞的誘導(dǎo)活化NIH/3T3細(xì)胞的活化效果呈現(xiàn)出TGF-β1濃度依賴性和時間依賴性。我們用ImageJ軟件對Western blot條帶定量分析后,發(fā)現(xiàn)TGF-β1以10 ng/ml的濃度處理NIH/3T3細(xì)胞48 h后,活化效果最好。3.體外細(xì)胞毒性實驗納米材料對A549和CAFs細(xì)胞毒性較低,可以被用于遞藥載體。而藥物的細(xì)胞毒性結(jié)果顯示,CPNP_(VCR)對細(xì)胞有顯著的毒性作用,當(dāng)CPNP_(VCR)和PPNP_(PFD)共遞藥時,細(xì)胞毒性顯著增強,且具有一定的協(xié)同作用。4.生物效應(yīng)和機理研究當(dāng)A549和CAFs共培養(yǎng)后,A549的細(xì)胞密度顯著高于A549單獨培養(yǎng)時,表明CAFs在一定程度上能夠促進A549細(xì)胞的增殖。當(dāng)共培養(yǎng)模型經(jīng)過共遞藥CPNP_(VCR)+PPNP_(PFD)處理后,結(jié)果顯示CAFs的生長被抑制后,可以顯著提高抗癌藥物VCR的治療效果。同時,我們還發(fā)現(xiàn)抗纖維化藥物PFD(也是一種TGF-β1的抑制劑)不僅可以逆轉(zhuǎn)CAFs細(xì)胞由激活狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o息狀態(tài),而且還可以抑制NIH/3T3細(xì)胞被TGF-β1誘導(dǎo)為CAFs細(xì)胞。結(jié)論在本研究中,我們創(chuàng)新性設(shè)計并制備了一種二元混合藥物聯(lián)合遞送納米顆粒(BBN-DCD):CPNP_(VCR)和PPNP_(PFD)。該納米共遞藥系統(tǒng)具有不同的pH響應(yīng)性,可以通過抑制癌相關(guān)成纖維細(xì)胞CAFs的增殖,而顯著增強抗癌藥物VCR對腫瘤細(xì)胞A549的毒性作用。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R943
【圖文】：

第二章 納米粒的制備及表征4 結(jié)果4.1 納米粒的制備如圖 1 所示，我們采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備了 CPNPVCR，采用薄膜分散法制備了 PPNPPFD，然后將二者物理混合得到二元混合藥物聯(lián)合遞送納米顆粒（BBN-DCD）。

圖 2. 納米粒的透射電鏡圖和粒徑分布圖。(A) CPNP; (B) CPNPVCR; (C) PPNP; (D)PPNPPFDFigure 2. The TEM images and distribution of nanoparticles. (A) CPNP; (B) CPNPVCR; (C) PPNP;(D) PPNPPFD4.3 粒徑及 Zeta 電位如表 1 所示，動態(tài)光散射實驗結(jié)果顯示，CPNP、PPNP、CPNPVCR和PPNPPFD的粒徑分別為 138.27 ± 1.11 nm，119.4 ± 0.78 nm，186.1 ± 10.69 nm 和125.86 ± 1.23 nm。載藥后的納米粒的粒徑比不載藥的納米粒稍微大一些，這可能是因為藥物被物理荷載到納米粒內(nèi)核所致。此外，納米粒表面電荷均帶負(fù)電荷，這在一定程度上能有效避免納米粒在血液運輸過程因電荷相反而聚集成團。表 1 納米粒的平均粒徑和 Zeta 電位Table 1 Mean diameter and zeta potential of nanoparticlesMean Diameter(nm) Zeta Potential(mV)

第二章 納米粒的制備及表征4.4 二元納米粒水溶液混合后的分散情況由于我們使用的模式藥 VCR 和 PFD 本身不帶熒光，為了使我們制備的納米�？梢暬�，我們在制備納米粒的過程中用 Rh123（顯紅色熒光）代替 VCR 以標(biāo)記CPNP，用C6（顯綠色熒光）代替PFD以標(biāo)記PPNP。然后取等質(zhì)量的CPNPRh123和 PPNPC6物理混合后用去離子水（pH=7.4）重懸，并置于搖床上震動孵育（37 ℃，100 rpm）2 h 后，吸取少量混懸液滴加到激光共聚焦皿內(nèi)。圖 3 中可以看出，紅色熒光和綠色熒光沒有重疊的現(xiàn)象，即可說明二元混合納米粒在水溶液中可以均勻分散，相互之間沒有吸附聚集。這歸因于兩種納米粒表面電荷均為負(fù)電荷，同種電荷相斥的原理。

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄭曉斌;陳作良;;口腔癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的研究進展[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2010年02期

2 孫鑫;何永文;;腫瘤微環(huán)境和口腔癌相關(guān)成纖維細(xì)胞[J];國際病理科學(xué)與臨床雜志;2009年04期

3 安美霞;吳開力;林少春;胡世興;;漢防己甲素對翼狀胬肉成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的影響[J];國際眼科雜志;2007年04期

4 王健;唐捷;蔣秋云;;成纖維細(xì)胞在骨創(chuàng)傷修復(fù)過程中的作用[J];中國基層醫(yī)藥;2007年08期

5 王繼峰,牛建昭;外周血中一種分泌膠原的新型細(xì)胞——循環(huán)成纖維細(xì)胞[J];解剖學(xué)報;2005年06期

6 劉強,柴家科;成纖維細(xì)胞與皮膚替代物的研究與應(yīng)用[J];中華燒傷雜志;2004年04期

7 盧旭華,陳德玉,趙定麟;成纖維細(xì)胞成骨潛能的研究進展[J];骨與關(guān)節(jié)損傷雜志;2004年08期

8 蔣俊,徐nr,尚宇陽,張妍;介紹一種簡易的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法[J];實用手外科雜志;2001年02期

9 張建華,蘇波,張素貞;兔角膜成纖維細(xì)胞的兩種培養(yǎng)方法[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1998年04期

10 崔玉芳,楊紅,高亞兵,熊呈琦,夏國偉,王德文;5-羥色胺對正常和受照射成纖維細(xì)胞生長的影響[J];輻射研究與輻射工藝學(xué)報;1998年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 李繼坤;薛小平;楊秀竹;李東華;張艷萍;郭世鐸;;中藥調(diào)控成纖維細(xì)胞活性的實驗研究[A];第七屆全國中西醫(yī)結(jié)合普通外科臨床及基礎(chǔ)研究學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

2 賀倩茹;從猛;丁斐;;感覺與運動神經(jīng)成纖維細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[A];中國解剖學(xué)會2019年年會論文文摘匯編[C];2019年

3 劉定志;肖衡;杜成友;羅詩樵;;腫瘤上清液激活成纖維細(xì)胞后對血管內(nèi)皮生長因子-A表達影響[A];2012中國器官移植大會論文匯編[C];2012年

4 張海波;胡甜甜;吳金鵬;呂恒勇;;針灸對成纖維細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用研究進展[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第三十三屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2013年

5 李亞東;牛建昭;田如玉;李銀生;張會存;解克芳;王繼峰;;人循環(huán)成纖維細(xì)胞的分離和鑒定[A];第八屆全國中西醫(yī)結(jié)合實驗醫(yī)學(xué)研討會論文匯編[C];2006年

6 陳若澤;甘小敏;梁瑩;唐德思;莫肖敏;;成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的電鏡觀察[A];第五次全國電子顯微學(xué)會議論文摘要集[C];1988年

7 劉杰峰;趙超莉;龍忠恒;許幼文;謝挺;;抑瘢檫劑對成纖維細(xì)胞的生物學(xué)的作用[A];第八屆全國燒傷外科學(xué)年會論文匯編[C];2007年

8 聶倩倩;文歡;姜支農(nóng);鄧紅;;原代結(jié)直腸癌相關(guān)成纖維細(xì)胞特征分析[A];2015年浙江省醫(yī)學(xué)會病理學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2015年

9 楊慶;王興桂;李程;劉峰;陳波;;基本機械力學(xué)刺激對腧穴筋膜成纖維細(xì)胞力感受器分子整合素α1、α3亞基表達影響研究[A];中國針灸學(xué)會經(jīng)絡(luò)分會第十二屆全國針灸經(jīng)絡(luò)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2012年

10 辛國華;羅旭;張友來;萬子楊;曾元臨;;改良五黃油對成纖維細(xì)胞生長增殖的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會燒傷外科學(xué)分會2009年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 首席記者 劉志勇 通訊員 劉文琴 林偉吟;精準(zhǔn)干預(yù)成纖維細(xì)胞能抑制腫瘤[N];健康報;2018年

2 記者 劉海英;英發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞具有不同類型[N];科技日報;2013年

3 劉霞;美成功將成纖維細(xì)胞直接變?yōu)樾募〖?xì)胞[N];科技日報;2010年

4 記者 譚嘉 通訊員 肖鑫 王澤鋒;成纖維細(xì)胞向干細(xì)胞分化途徑找到[N];健康報;2013年

5 記者 白毅;人類成纖維細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞定向轉(zhuǎn)分化首獲成功[N];中國醫(yī)藥報;2013年

6 記者 劉霞;物理特性被證實可助推細(xì)胞“返老還童”[N];科技日報;2013年

7 本報記者 王婷婷;李善剛：兩例克隆兔,一顆平常心[N];科技日報;2007年

8 暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心 李校X 姚成燦;bFGF肌膚“裝修”揭秘[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

9 本報記者 孟剛;幫你認(rèn)識高機能水[N];中國消費者報;2009年

10 編譯 李勇;微環(huán)境可作為抗癌藥研發(fā)新靶點[N];中國醫(yī)藥報;2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李珊;組蛋白去乙�；冈谔匕l(fā)性間質(zhì)性肺炎發(fā)病機制中的初步探索[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2019年

2 李全;ADSC-exo對肉芽組織成纖維細(xì)胞增殖影響及修復(fù)裸鼠皮膚缺損的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

3 王利敏;腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移及耐藥中的作用及分子機制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

4 陳俞帆;Pappa2基因通過IGF信號通路影響小鼠髖關(guān)節(jié)發(fā)育[D];中國醫(yī)科大學(xué);2019年

5 張東亞;CAFs通過lncRNALOC10050611促進OSCC發(fā)展和耐藥的研究[D];南京大學(xué);2019年

6 李自良;PDGF-BB因子誘導(dǎo)口腔黏膜成纖維細(xì)胞活化的作用及機制研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2018年

7 曹黎;Ang-(1-7)通過抑制NCX1/Ca~(2+)/CaMKII通路拮抗AngⅡ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

8 李文倩;卵巢癌中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌外泌體中的TGFβ1促進腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的研究[D];華中科技大學(xué);2018年

9 吳曉東;成纖維細(xì)胞CD147分子重編程腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)乳腺癌進展的功能研究[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

10 李文佼;羊膜成纖維細(xì)胞表達的血清淀粉樣蛋白A1調(diào)控促炎性基因表達的研究[D];上海交通大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 葉

本文編號：2771420