【摘要】：由細(xì)菌引起的感染一直以來都是威脅人類健康的一大常見及多發(fā)性疾病,嚴(yán)重的情況下甚至危及患者生命安全。隨著1928年青霉素的發(fā)現(xiàn)及后續(xù)多種抗菌藥物的應(yīng)用,數(shù)千萬的生命得以救治,為保障人類健康立下了不可磨滅的功績。然而,抗菌藥物的使用不可避免地會導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生,尤其是近些年來抗菌藥物的大范圍使用甚至濫用,使得細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的時間大大縮短,然而對新型抗菌藥物的研發(fā)卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上這一速度。如今日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性無疑加劇了臨床感染的威脅,我們擔(dān)心不久的將來,面對多藥耐藥菌,將無一抗菌藥物對其有效,人類將重新回到20世紀(jì)前的無青霉素年代。物競天擇,適者生存。細(xì)菌因抗菌藥物的出現(xiàn)進(jìn)化出耐藥性,因此,規(guī)范合理的使用抗菌藥物可減小細(xì)菌的進(jìn)化壓力從而減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。此外,抗菌新靶點的發(fā)現(xiàn)及其有效藥物的研發(fā)也將是回?fù)裟退幮约?xì)菌的一種更加直接有效的手段。絲狀溫度敏感蛋白Z(FtsZ)是參與細(xì)菌細(xì)胞分裂的一種關(guān)鍵蛋白,干預(yù)其正常的生物學(xué)功能將導(dǎo)致細(xì)菌分裂受阻,最終使細(xì)菌死亡。因此FtsZ可作為一個抗菌藥物研發(fā)非常有前景的新靶點,并且已報道的多種FtsZ抑制劑顯示出了優(yōu)良的抗菌活性。其中,由3-甲氧基苯甲酰胺(3-MBA)修飾而來的2,6-二氟苯甲酰胺衍生物是一類非常有代表性的FtsZ抑制劑,其相關(guān)靶向作用、分子機制、體內(nèi)外生物活性、蛋白共晶結(jié)構(gòu)等均有不同程度的研究報道,因此受到世界范圍內(nèi)抗菌研發(fā)機構(gòu)的廣泛關(guān)注。但目前此類化合物僅處于臨床前研究當(dāng)中,對其結(jié)構(gòu)進(jìn)一步的優(yōu)化篩選及開發(fā)仍具有重要意義。有鑒于此,我們以3-MBA類似物為起點,通過基于結(jié)構(gòu)的合理藥物設(shè)計以及計算機輔助藥物設(shè)計,對此類化合物進(jìn)行了多輪廣泛且細(xì)致的結(jié)構(gòu)篩選及優(yōu)化,設(shè)計并合成了 21個系列共計182個化合物,后續(xù)對其體內(nèi)外抗菌活性、細(xì)菌形態(tài)、蛋白靶向作用、生物穩(wěn)定性等進(jìn)行了評價。之前的研究發(fā)現(xiàn),苯甲酰胺類FtsZ抑制劑結(jié)構(gòu)中的甲酰胺鍵對蛋白結(jié)合力及抗菌活性貢獻(xiàn)極大,因此針對其關(guān)鍵藥效團甲酰胺進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,對研究該類型化合物與FtsZ蛋白間的相互作用及結(jié)合模式、探索新的結(jié)構(gòu)類型的抗菌藥物具有重要意義。我們通過生物電子等排策略,將甲酰胺替換為三氮唑、VA二唑、酰肼、脲等結(jié)構(gòu),設(shè)計合成了 A至K十一個系列共52個化合物。經(jīng)過體外活性篩選,我們發(fā)現(xiàn)其中以1H-1,2,3-三氮唑替換后的衍生物B6具有較好的抗菌活性,對所測四種革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌、敏感及耐藥的金黃色葡萄球菌)的MIC在24 μg/mL之間。然而其甲酰胺結(jié)構(gòu)的母體化合物活性僅為16 μg/mL。說明1,2,3-三氮唑在該系列結(jié)構(gòu)中相較于甲酰胺表現(xiàn)出更強的抗菌活性,為開發(fā)新穎結(jié)構(gòu)的抗菌藥物提供了優(yōu)質(zhì)先導(dǎo)物。靶向FtsZ的藥物都能造成細(xì)菌形態(tài)變大或延長,然而對B6進(jìn)行的靶向測試結(jié)果發(fā)現(xiàn),B6并不造成細(xì)菌形態(tài)的顯著變化;并且B系列苯基三氮唑類的構(gòu)效關(guān)系也與苯甲釀胺類的研究結(jié)論不符。因此我們推斷,該系列化合物雖然具有較好的抗菌活性,但其作用靶點可能不是FtsZ。為此我們進(jìn)一步對其潛在作用靶蛋白進(jìn)行了研究探索。經(jīng)PharmMapper系統(tǒng)搜索預(yù)測,肽脫甲�；�(PDF)可能是其潛在作用靶點。后續(xù)又經(jīng)LigsitCSC系統(tǒng)預(yù)測該蛋白的潛在結(jié)合口袋,以及計算機對接分析,發(fā)現(xiàn)B6能與PDF的結(jié)合位點生產(chǎn)較強的相互作用,1,2,3-三氮唑及醚氧原子與周圍氨基酸殘基形成氫鍵作用,烷基長鏈則與疏水區(qū)域相互作用。該結(jié)合模式能夠很好的解釋B系列的構(gòu)效關(guān)系,推測該類苯基三氮唑結(jié)構(gòu)的衍生物通過作用于PDF發(fā)揮抗菌活性,為進(jìn)一步探索先導(dǎo)物B6的作用機制提供了初步的研究方向。替換甲酰胺導(dǎo)致脫靶效應(yīng)后,我們便保留甲酰胺結(jié)構(gòu),對其3位親脂性側(cè)鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)探索和修飾。以苯甲酰胺、3位串聯(lián)芳環(huán)的藥效團為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),將異VA唑五元雜環(huán)引入到中間連接環(huán),設(shè)計合成了 3-芳基異VA唑-苯甲酰胺類衍生物,即系列L共計35個化合物。針對L系列化合物的活性篩選發(fā)現(xiàn)L25活性較好,對其進(jìn)行分子對接分析發(fā)現(xiàn),其結(jié)構(gòu)中的異VA唑環(huán)附近的Asp199氨基酸殘基可能是一個潛在的結(jié)合位點。通過計算環(huán)上N、O原子與該氨基酸游離羧基的距離,推測將N、O原子的位置交換之后,N原子距離Asp199羧基3.4A,兩者間可能形成離子偶極相互作用。由此設(shè)計了含有5-芳基異VA唑-苯甲酰胺類M系列共計21個化合物,即L系列中異VA唑環(huán)上N、O位置互換的衍生物。對該系列的化合物活性測試發(fā)現(xiàn),化合物M14,即L25中異VA唑環(huán)上N、O互換衍生物,具有比L25更好的抗菌活性,對兩株桿菌(枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌)的MIC從0.03、0.25 μg/mL降低至0.015、0.03 μg/mL,活性提高了2-8倍;對三株金黃色葡萄球菌(敏感、耐青霉素、耐甲氧西林)的MIC從8、4、8 μg/mL降低至2、2、4μg/mL,活性提高了24倍。通過計算機模擬對接分析,M14中異VA唑環(huán)上的N原子的確與Asp199氨基酸殘基產(chǎn)生了額外的相互作用;在FtsZ蛋白聚合實驗中,相同濃度的M14,相較于L25,能對FtsZ產(chǎn)生更強的聚合促進(jìn)作用,表明M14與FtsZ的結(jié)合作用更強。隨后在小鼠血液感染模型實驗中,M14表現(xiàn)出了較好的體內(nèi)抗菌活性,150 mg/kg分五次腹腔注射給藥能夠顯著降低小鼠血液中的菌量。M14針對哺乳動物Hela細(xì)胞系的IC50大于128 μg/mL,遠(yuǎn)高于其抗菌濃度,這也間接表明M14對哺乳動物微管蛋白無抑制作用。隨后進(jìn)一步對中間連接環(huán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)探索和優(yōu)化,設(shè)計了含有1,3,4-VA二唑-2-酮的N至S六個系列共計44個化合物。對系列中化合物的活性研究發(fā)現(xiàn)N14對四種金黃色葡萄球菌,包括三種耐藥菌的活性在0.5-1 μg/mL之間,為該系列活性最好化合物。而互換1,3,4-VA二唑-2-酮五元環(huán)兩側(cè)的藥效團取代位置得到Q系列化合物,將使抗菌活性消失,說明中間五元雜環(huán)與蛋白的靶位點有著特異性的適配。分子中引入一個亞甲基以延長分子長度及柔性得到O、P系列化合物,也將導(dǎo)致抗菌活性降低,這可能與靶點的結(jié)合口袋空間限制有關(guān)。但亞甲基引入的位置對活性影響的程度并不相同,引入到-O-C-橋上形成-O-C-C-橋后活性降低程度較小,推測與三個原子鏈的柔性及可伸縮性有關(guān)。出于對1,3,4-VA二唑-2-酮環(huán)中內(nèi)酯鍵潛在生物穩(wěn)定性問題的考慮,我們設(shè)計了將環(huán)中O原子替換為N、C原子的R、S系列衍生物。體外血漿穩(wěn)定性實驗表明該設(shè)計策略極大的提高了分子生物穩(wěn)定性,化合物R1經(jīng)24小時后含量幾乎不變,而N14的血漿半衰期僅為2.5小時。但1,3,4-VA二唑-2酮環(huán)中O原子替換為N、C后的系列化合物抗菌活性均消失,通過計算發(fā)現(xiàn)N14的Log P值為3.41,其環(huán)上O替換為N、C后的衍生物R1、S2的Log P分別為2.74、2.69,極性明顯變大。因FtsZ在該結(jié)合位點為一疏水性空腔,推測R、S系列化合物抗菌活性消失主要是由親脂性降低及空間體積效應(yīng)引起的。T、U兩個系列共計30個化合物在分子構(gòu)像上做了較大改動,將L、M系列中的異VA唑環(huán)改為異VA唑啉環(huán)。環(huán)中碳碳雙鍵到碳碳單鍵的替換使環(huán)上產(chǎn)生一個手性碳,并造成與之相連部分的非共面結(jié)構(gòu),整個分子的構(gòu)象更加靈活多變,以研究探索該類彎曲構(gòu)型的分子與蛋白的誘導(dǎo)契合結(jié)合模式。對此系列化合物的活性篩選發(fā)現(xiàn)T16具有最強抗菌活性,對包括三種耐藥菌在內(nèi)的四種金黃色葡萄球菌抗菌活性在0.25-0.5 μg/mL之間,優(yōu)于對照品PC190723及臨床藥物利奈唑胺、環(huán)丙沙星、紅霉素,為本課題設(shè)計合成的所有系列中活性最好化合物。由于T16為外消旋體,推測其R或S構(gòu)型的單一純品抗菌活性會更好。T16-R、T16-S與FtsZ的分子對接結(jié)果顯示,兩者的結(jié)合模式幾乎重疊;對接分?jǐn)?shù)顯示R構(gòu)型結(jié)合力稍高于S構(gòu)型。與PC190723-FtsZ共晶中呈平面狀的結(jié)合模式不同,T16分子以一種類似“M”型構(gòu)象結(jié)合于靶位點,這與我們設(shè)計的初衷相符。在誘導(dǎo)契合結(jié)合作用模式下,這種略微彎曲的分子結(jié)構(gòu)可能與結(jié)合口袋凹凸不平的氨基酸殘基表面更加適配,形成互補的“鎖鑰模型”,因而使得其抗菌活性較好于PC190723。初步的細(xì)胞毒性實驗表明,該外消旋體T16對哺乳動物Hela細(xì)胞幾乎無毒性作用,IC5564 μg/mL,遠(yuǎn)高于其抑菌濃度。后續(xù)的對應(yīng)異構(gòu)體拆分及活性毒性方面的特性應(yīng)進(jìn)一步被研究探索,以確定其臨床應(yīng)用前景。通過設(shè)計合成以上二十一個系列共計182個化合物,并對其進(jìn)行初步的生物活性評價,我們發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)中分別含有4-叔丁基苯基異VA唑、4-溴苯基VA二唑酮、4-正丁基苯基異VA唑啉結(jié)構(gòu)的M14、N14、T16三個苯甲酰胺衍生物具有最好的抗菌活性。構(gòu)效分析發(fā)現(xiàn),上述活性突出的化合物分子結(jié)構(gòu)末端都為苯環(huán),且苯環(huán)上普遍連有烷基鏈或是鹵素等親脂性取代基,這與FtsZ蛋白在該結(jié)合區(qū)域大多為疏水性氨基酸殘基有關(guān)。中間雜環(huán)左側(cè)連接的苯甲酰胺活性必須基團與靶蛋白形成主要的氫鍵作用力,右側(cè)連接的取代芳環(huán)與靶蛋白的疏水性區(qū)域相互作用,表面上看中間五元雜環(huán)只起到連接左右兩部分藥效團的作用,但實際上中間五元雜環(huán)的空間體積及結(jié)構(gòu)特征對活性有重要影響。例如其環(huán)上取代基大小、環(huán)上雜原子的組成,不僅對靶位點的結(jié)合起著重要作用,而且能夠影響到整個分子的生物穩(wěn)定性及藥代動力學(xué)性質(zhì)。尤其是左右兩側(cè)的藥效團結(jié)構(gòu)及性質(zhì)已基本確定、改造空間有限的情況下,對于中間連接環(huán)的結(jié)構(gòu)改造仍有很大的余地,這也將是進(jìn)一步提高抗菌活性并改善整個分子成藥性的重要優(yōu)化部位。我們在本研究當(dāng)中以苯甲酰胺類FtsZ抑制劑為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),依據(jù)生物電子等排原理、基于結(jié)構(gòu)的骨架優(yōu)化、計算機輔藥物設(shè)計等策略設(shè)計合成了多個系列的衍生物,并從中發(fā)現(xiàn)了多個抗菌活性突出的先導(dǎo)物,在體內(nèi)、體外及靶蛋白水平都體現(xiàn)出較好的活性。本研究中眾多骨架多樣性的活性分子不僅為研究苯甲酰胺類抑制劑與FtsZ靶蛋白的作用方式、設(shè)計靶向FtsZ的抗菌化合物提供了可靠的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),并為進(jìn)一步的生物活性及成藥性優(yōu)化、開發(fā)結(jié)構(gòu)新穎、作用機制獨特的新一代抗菌藥物提供了高質(zhì)量的先導(dǎo)物,以對抗全球日益嚴(yán)峻的耐藥菌問題。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R914


本文編號：2768498