【摘要】：紫草素的藥理作用廣泛,具有抗炎,抗病毒和抗氧化等作用,尤其是具有良好的抗癌作用,并且這些作用引起了大家的廣泛關注。然而,因為它具有相對副作用和毒性,其潛在的效用是有限的。為了開發(fā)具有高效和低毒性的分子,本課題以紫草素為母核設計和合成21個靶向PI3K的紫草素衍生物,所有合成的化合物已通過~1H-NMR、~(13)C-NMR和HR-MS驗證。首先通過MTT實驗在人胃癌細胞(SGC-7901),人胃癌細胞(MGC-803),人肝癌細胞(SMMC-7721),人膠質瘤細胞(U-87),人正常肝細胞(L-02)上對21個紫草素衍生物進行初步活性評價,結果顯示化合物4s在人胃癌細胞SGC-7901更具研究意義,因此我們開展了一系列對化合物4s抗腫瘤的機制研究。我們通過集落克隆實驗和細胞周期實驗進一步研究化合物4s對細胞增殖的作用;AnnexinV/PI雙染法和蛋白印跡法檢測化合物4s是否誘導細胞發(fā)生了凋亡;吖啶橙染色法、GFP-LC3轉染法、免疫熒光法和蛋白印跡實驗研究細胞自噬;然后通過AnnexinV/PI雙染法檢和蛋白印跡法探討細胞自噬在化合物4s促細胞凋亡作用中所起的作用;最后Western blot實驗檢測化合物4s對磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)通路的影響,進一步通過分子對接去研究化合物是否與PI3K蛋白有作用。實驗結果顯示集落形成率隨化合物4s濃度增大而降低,細胞增殖被抑制;化合物4s將細胞阻滯在G1期的比例呈濃度依賴性增加,細胞增殖被抑制與被阻滯在G1期有關;化合物4s在SGC-7901上的凋亡率隨濃度增大(1,2,4μM)而增加,凋亡相關蛋白Bax和cl-PARP水平上調、Bcl-2及PARP下調,表明化合物4s誘導細胞凋亡,被阻滯在G1期的細胞發(fā)生了凋亡;自噬溶酶體和LC3蛋白的增加說明細胞自噬的發(fā)生;當化合物與自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)共孵育時,細胞凋亡率受到抑制,說明自噬在化合物4s的細胞凋亡作用中起促進作用;化合物4s通過PI3K/AKT/mTOR負調控細胞自噬。初步機制表明,化合物4s可通過抑制PI3K/AKT/mTOR途以自噬依賴性方式介導細胞凋亡。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914;R96
【圖文】：

我們通過反向找靶來尋找紫草素的靶點(圖2)，發(fā)現(xiàn)了抗腫瘤過程中重要的靶點 PI3K(PDB:2CHW)[32]。將 PIK39 與 PI3Kγ對接，如圖 3 顯示 Val-882 和 Glu-880 分別與嘧啶環(huán)上的 N 和咪唑環(huán)上的 NH 形成氫鍵相互作用。Lys-802，Pro-810 和 Met-804 等多個氨基酸殘基與苯并嘧啶酮上的苯環(huán)發(fā)生疏水相互作用，此外，Met-804 和 Met-953 殘基上的 S 原子分別與吡啶酮和嘧啶環(huán)形成 Pi-S 相互作用。Trp-812 與苯環(huán)形成 Pi-δ相互作用。Tyr-867，Phe-961與咪唑環(huán)形成 Pi-Pi 相互作用。為了合成基于紫草素母核的新型 PI3K 抑制劑，我們設計出了一系列的紫草素衍生物。將紫草素衍生物與 PI3K（PDB:2CHW）進行對接，發(fā)現(xiàn)它們具有較低的相互作用能，并且優(yōu)于 PIK39 和紫草素（表 1）。因此

對 HL60 和 K562 細胞系具有很強的抗癌活性[29]。Rao 發(fā)現(xiàn)β-羥基異戊酰紫草素（圖1，3）對人前列腺癌細胞 DU-145 具有很強的抑制作用和選擇性毒性[30]。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)異戊酰紫草素（圖 1，4）和 SH-7（圖 1）對白血病 HL-60 細胞和A549 細胞均有明顯的抑制作用，誘導細胞凋亡，并且兩種化合物均強于紫草素[31]。為了合成更高效低毒的紫草素衍生物，我們通過反向找靶來尋找紫草素的靶點(圖2)，發(fā)現(xiàn)了抗腫瘤過程中重要的靶點 PI3K(PDB:2CHW)[32]。將 PIK39 與 PI3Kγ對接，如圖 3 顯示 Val-882 和 Glu-880 分別與嘧啶環(huán)上的 N 和咪唑環(huán)上的 NH 形成氫鍵相互作用。Lys-802

圖 3. PIK39 與 PI3Kγ對接的結果Figure 3. The docking results of PIK39 and PI3Kγ表 1 代表性的紫草素衍生物骨架結構虛擬篩選的結果。Table 1. Representative shikonin skeleton structures through virtual screening.Compounds -CDOCKER INTERACTION ENERGY (kcal/mol)53.0399

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