【摘要】：生物大分子與生物大分子或小分子的相互作用廣泛存在于生物體的許多生理過程中,如基因轉(zhuǎn)錄、信號傳導、酶催化過程等。受體理論認為,藥物產(chǎn)生藥效的前提之一是藥物分子與受體產(chǎn)生特異性結(jié)合。因此,評價生物大分子與生物大分子或小分子的相互作用具有重要的意義。目前,毛細管電泳(Capillary electrophoresis,CE)已廣泛應用于核酸、蛋白質(zhì)、細胞膜、細菌或細胞與小分子的相互作用研究。血小板膜受體和凝血酶作為抗血栓形成治療中最主要的藥物作用靶標已被用于抗血栓形成活性成分的評價或篩選。本文分別采用前沿分析毛細管電泳法(Frontal analysis capillary electrophoresis,FACE)及親和毛細管電泳法(Affinity capillary electrophoresis,ACE)評價了血小板與小分子,凝血酶與小分子的相互作用;并建立了基于毛細管電泳的在線固定化凝血酶微反應器用于凝血酶抑制劑的篩選。本論文主要包括以下五個部分:第一部分為緒論部分,簡述了血小板、凝血酶在血栓形成過程中的重要作用;以血小板、凝血酶為受體靶的抗血栓形成活性成分的篩選及評價研究進展;CE在核酸、蛋白質(zhì)、細胞膜、細菌及細胞與小分子相互作用評價中的應用;以及基于CE的酶微反應器的研究進展。第二部分基于聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)動態(tài)毛細管涂層,應用FACE法分別測定了血小板與8個生物堿小分子化合物(海罌粟堿、木蘭花堿、脫氫紫堇堿、小檗堿、巴馬汀、異鉤藤堿、鉤藤堿和馬錢子堿)的位點結(jié)合常數(shù)及化學計量數(shù)。結(jié)果顯示海罌粟堿、脫氫紫堇堿及異鉤藤堿與血小板具有較強的相互作用。第三部分采用ACE法測定了凝血酶與10個酚類化合物(對羥基苯甲酸、原兒茶酸、香草酸、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、二氫槲皮素、柚皮素、芹菜素和黃芩素)的結(jié)合常數(shù),在結(jié)合常數(shù)計算過程中,引入了“淌度比”的概念以消除緩沖液粘度變化對結(jié)合常數(shù)測定的影響。同時,通過分子對接技術(shù)獲得了6個黃酮化合物(兒茶素、表兒茶素、二氫槲皮素、柚皮素、芹菜素和黃芩素)與凝血酶活性中心結(jié)合的最佳構(gòu)象及作用氨基酸殘基。ACE結(jié)果顯示沒食子酸及6個黃酮化合物與凝血酶具有較強的相互作用。分子對接結(jié)果顯示6個黃酮化合物與凝血酶對接的最佳構(gòu)象均位于凝血酶活性中心并與催化三元組中的SER195或HIS57存在作用。第四部分建立了基于毛細管電泳的在線凝血酶固定化酶微反應器(Immobilized enzyme microreaction,IMER)并應用于表兒茶素(Epicatechin,EC)、表沒食子酸兒茶素(Epigallocatechin,EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG)、表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)的抗凝血酶活性評價。同時,通過分子對接技術(shù)從分子水平上分析了兒茶素抑制凝血酶的作用機制。實驗結(jié)果顯示毛細管電泳凝血酶IMER已成功建立,并可用于凝血酶抑制劑的篩選。凝血酶抑制試驗結(jié)果顯示ECG和EGCG具有顯著凝血酶抑制作用,進一步分子對接結(jié)果顯示ECG和EGCG結(jié)構(gòu)中的苯并吡喃環(huán)插入了凝血酶的催化活性口袋,并與LYS60F、TRP60D、TRY60A、IEU99、GLY216、HIS57和SER195等產(chǎn)生相互作用。第五部分為實驗總結(jié)及展望。基于CE在生物樣品分離、分析中所具有的獨特優(yōu)勢,CE技術(shù)將在細胞、蛋白質(zhì)與小分子的相互作用研究中發(fā)揮重要作用,而結(jié)合分子對接技術(shù)可為小分子的作用機制研究及藥物篩選提供重要的參考依據(jù)。此外,基于CE的在線IMER具有酶量消耗少、穩(wěn)定性好等優(yōu)點也可直接用于酶抑制劑的篩選。
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R914
【圖文】：

重慶大學碩士學位論文PⅡb/Ⅲa 抑制劑。其中，ADP 受體拮抗劑如氯吡格雷、普拉格劑 ADP 與受體 P2Y12的結(jié)合從而抑制血小板活化；纖維蛋白原單抗、替羅非班是通過抑制活化的 GPⅡb/Ⅲa 與纖維蛋白原結(jié)的聚集。這三類抗血小板聚集藥物顯著降低了心血管疾病的發(fā)們?nèi)源嬖谝欢ǖ牟涣挤磻�，如胃腸道反應、血小板減少、出血新的抗血小板聚集藥物仍具有一定的必要性。

圖 1.2 凝血級聯(lián)反應中的外源性、內(nèi)源性、共同凝血途ure 1.2 Extrinsic, intrinsic and common pathways of coagulatio具有自我放大和自我制約兩方面的特性，表現(xiàn)為凝反饋激活凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅺ和凝血酶原有利于在需要形成止血栓的部位迅速發(fā)生血液的凝能破壞因子Ⅷa 和Ⅴa，故亦有防止不適當過度凝血是通過抑制凝血酶活性或者減少凝血酶的生成以達用的抗凝血藥物主要包括：傳統(tǒng)抗凝藥如肝素（普素 K 抑制劑（華法林）及新型抗凝藥如直接凝血酶見表 1.1）[19]。傳統(tǒng)抗凝藥物在臨床應用中需要密并存在嚴重出血等副作用，而新型抗凝藥僅對單個與食物或藥物的交叉反應、使得其生物利用度提高低[20]。表 1.1 凝血酶及凝血因子Ⅹa 抑制劑

圖 1.3 毛細管電泳中常用的結(jié)合常數(shù)測定方法比較Figure 1.3 The common methods for determination of binding constants in capillaryelectrophoresis① FACE 法在 FACE 法中，毛細管預先充滿電泳緩沖液，然后將藥物與蛋白質(zhì)的平衡液大體積進樣，在電場驅(qū)動下，樣品組分的區(qū)帶則由最初的疊加狀態(tài)向分離狀態(tài)過渡，最終形成連續(xù)或獨立的平臺峰。平臺峰的高度不受毛細管長度、應用電壓、遷移時間及電滲流的影響，因此，在實驗過程中應盡量保證平臺峰的形成。游離藥物的平臺峰高度與其濃度呈線性關(guān)系，由此可以計算出游離藥物的濃度，然后計算得到結(jié)合常數(shù)及化學計量數(shù)。FACE 法適用于強結(jié)合、慢動力學體系，在研究蛋白質(zhì)與藥物相互作用時需要滿足以下兩個條件：一是藥物與藥物-蛋白質(zhì)復合物具有不同的遷移速率；二是蛋白質(zhì)與藥物-蛋白質(zhì)復合物具有相同的遷移速率。② ACE 法

【參考文獻】

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