【摘要】：離子型谷氨酸受體(ionotropic glutamate receptor,iGluRs)通過(guò)偶聯(lián)離子通道,使突觸后神經(jīng)元去極化,介導(dǎo)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大部分的快速興奮性神經(jīng)傳遞。離子型谷氨酸受體根據(jù)各個(gè)亞群的同源性和藥理學(xué)特征,可以將其分為4種:N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體、α-氨基-3-羥基-5-基-4-異惡唑(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole acid,AMPA)受體、海人藻酸(kainate acid,KA)受體和孤兒受體。所有的谷氨酸受體亞單位的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)相同,均是從細(xì)胞膜外N端起始,依次包括氨基端結(jié)構(gòu)域(ATD)、配體-受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)、由三個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,一個(gè)折返環(huán)路構(gòu)成的離子孔道區(qū)形成的跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)和一個(gè)伸向胞內(nèi)的尾巴C端(CTD)組成。AMPA受體是由一種或者多種亞單位[Glu(A1-4)]組成的四聚體,快速激活并快速脫敏是AMPA受體通道最重要的特征。大量研究表明,許多膜蛋白與離子型谷氨酸受體相互作用,共同調(diào)節(jié)谷氨酸受體的功能和表達(dá),這些蛋白被命名為谷氨酸受體輔助亞單位。其中輔助亞單位TARPs(transmembrane receptor regulatory proteins)通過(guò)與AMPA受體的相互作用,參與調(diào)節(jié)AMPA受體的表達(dá)和功能。Stargazin(STZ,γ_2)蛋白是第一個(gè)被鑒定的TARPs成員,來(lái)源于基因突變小鼠,通過(guò)減弱失活和脫敏而增強(qiáng)AMPA受體活性,增強(qiáng)脫敏后的恢復(fù),并具有調(diào)節(jié)AMPA受體藥理學(xué)功能的特性。但STZ如何精確調(diào)節(jié)AMPA受體通道功能目前還不十分清楚。奧拉西坦(oxiracetam,ox)和茴拉西坦(aniracetam,ani)屬于吡咯烷酮類益智藥,是γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)衍生物,在臨床上廣泛應(yīng)用于治療認(rèn)知障礙,改善學(xué)習(xí)記憶能力。此類益智藥均是基于對(duì)吡拉西坦進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而合成的吡拉西坦衍生物,作用于AMPA受體,調(diào)節(jié)AMPA受體的功能,屬于AMPA受體調(diào)節(jié)藥。奧拉西坦是吡拉西坦的類似物,其藥效為第一代吡咯烷酮類益智藥吡拉西坦的3-5倍,茴拉西坦是吡拉西坦的N-側(cè)鏈衍生物,藥效也強(qiáng)于吡拉西坦,但奧拉西坦和茴拉西坦對(duì)于AMPA受體分子的確切藥理作用機(jī)制尚不清楚。因此本研究應(yīng)用分子生物學(xué)和電生理學(xué)技術(shù),研究了Stargazin和AMPA受體相互作用的精確調(diào)控機(jī)制,以及奧拉西坦和茴拉西坦對(duì)AMPA受體不同亞型的影響。第一部分AMPA受體與Stargazin之間的靜電吸引力對(duì)AMPA受體動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響目的:通過(guò)改變AMPA受體或Stargazin某位點(diǎn)的氨基酸種類,改變AMPA受體和Stargazin之間的靜電吸引力,以此探究AMPA受體和Stargazin之間的靜電吸引力對(duì)AMPA受體功能的影響。方法:將分子生物學(xué)技術(shù)和電生理學(xué)技術(shù)相結(jié)合,利用基因點(diǎn)突變和膜片鉗外面向外細(xì)胞記錄方法,來(lái)探究AMPA受體和Stargazin之間的靜電吸引力對(duì)AMPA受體通道亞型GluA2通道動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。結(jié)果:1.10 mM谷氨酸作為激動(dòng)劑,記錄AMPA受體通道亞型GluA2通道及共表達(dá)STZ電流的變化。對(duì)照組共轉(zhuǎn)Glu A2+STZ時(shí),AMPA受體通道亞型GluA2通道的激活時(shí)間常數(shù)τ為0.26±0.09(ms);當(dāng)進(jìn)行氨基酸點(diǎn)突變,無(wú)論全部或部分減弱STZ和AMPA受體之間的相互作用時(shí),共轉(zhuǎn)GluA2+STZ突變體的激活時(shí)間常數(shù)均明顯延長(zhǎng),如共轉(zhuǎn)Glu A2+STZ-4A通道的激活時(shí)間常數(shù)τ為1.87±0.59(ms),明顯長(zhǎng)于STZ野生型共轉(zhuǎn)(P0.0001)。2.減弱STZ和AMPA受體間的相互作用對(duì)受體的去活過(guò)程影響不大,只有全部打破STZ和AMPA受體的相互間作用才能影響通道的去活過(guò)程。3.通過(guò)部分和全部將STZ和AMPA受體的相互作用交界面上的氨基酸電荷極性突變,我們發(fā)現(xiàn)交界面的氨基酸電荷相互排斥時(shí),明顯改變AMPA受體的激活、脫敏和去活過(guò)程過(guò)程。4.通過(guò)氨基酸點(diǎn)突變,我們找到了決定STZ影響AMPA受體的脫敏的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)(STZ-E90)。小結(jié):AMPA受體和Stargazin之間靜電吸引力促進(jìn)了AMPA受體的激活、脫敏、脫敏的平臺(tái)期電流和峰值電流的比值,對(duì)去活過(guò)程影響不明顯。第二部分奧拉西坦對(duì)AMPA受體通道亞型GluA2和GluA4通道的影響目的:研究奧拉西坦對(duì)AMPA受體通道亞型GluA2和GluA4通道的作用,在分子水平進(jìn)一步深入研究奧拉西坦益智作用的分子機(jī)理。方法:利用膜片鉗外面向外細(xì)胞記錄和給藥方法來(lái)確定奧拉西坦對(duì)AMPA受體通道亞型GluA2和GluA4通道的作用。結(jié)果:奧拉西坦可以明顯抑制AMPA受體通道亞型GluA2和GluA4通道的峰值電流和脫敏的平臺(tái)期電流。1.5 mM奧拉西坦可以使AMPA受體通道亞型Glu A2通道峰值電流與平臺(tái)期電流均減小,峰值電流減小至對(duì)照組電流的71.28±0.09(%),平臺(tái)期電流減小至對(duì)照組電流的61.46±0.05(%)。而對(duì)AMPA受體通道亞型GluA2通道的脫敏、去活及脫敏后再恢復(fù)動(dòng)力學(xué)特征均無(wú)顯著影響。2.5 mM奧拉西坦也可以使AMPA受體通道亞型Glu A4通道峰值電流與平臺(tái)期電流均減小,峰值電流減小至對(duì)照組電流的71.23±0.04(%),平臺(tái)期電流減小至對(duì)照組電流的67.16±0.05(%)。對(duì)AMPA受體通道亞型GluA4通道的脫敏、去活及脫敏后再恢復(fù)動(dòng)力學(xué)特征均無(wú)顯著影響。小結(jié):奧拉西坦通過(guò)與AMPA受體通道亞型Glu A2通道和GluA4通道結(jié)合,僅僅抑制了AMPA受體通道亞型Glu A2通道和GluA4通道的激活,而不影響AMPA受體通道亞型GluA4通道開(kāi)放后的功能狀態(tài)改變。第三部分茴拉西坦對(duì)AMPA受體通道亞型GluA2和GluA4通道的影響目的:研究茴拉西坦對(duì)AMPA受體通道亞型GluA2和GluA4通道的作用,在分子水平進(jìn)一步深入研究奧拉西坦益智作用的分子機(jī)理。方法:利用膜片鉗外面向外細(xì)胞記錄和給藥方法來(lái)確定茴拉西坦對(duì)AMPA受體通道亞型GluA2和GluA4通道的作用。結(jié)果:1.5 mM茴拉西坦不影響AMPA受體通道亞型GluA2和GluA4通道峰值電流與平臺(tái)期電流。2.茴拉西坦可以顯著減慢通道亞型GluA2通道電流的脫敏過(guò)程,明顯延長(zhǎng)脫敏時(shí)間(P0.0001)。并且茴拉西坦應(yīng)用后,AMPA受體通道的去活過(guò)程也顯著延長(zhǎng)(P0.05),但對(duì)AMPA受體通道亞型Glu A2通道脫敏再恢復(fù)過(guò)程沒(méi)有影響(P0.05)。3.茴拉西坦也可以顯著減慢通道亞型GluA4通道電流的脫敏過(guò)程,明顯延長(zhǎng)脫敏時(shí)間(P0.001)。并延長(zhǎng)GluA4通道的去活過(guò)程(P0.05),但對(duì)AMPA受體通道亞型GluA4通道脫敏再恢復(fù)過(guò)程沒(méi)有影響。小結(jié):茴拉西坦通過(guò)與AMPA受體通道亞型GluA2通道和GluA4通道結(jié)合,減慢了AMPA受體通道亞型GluA2通道和GluA4通道的關(guān)閉和脫敏過(guò)程,不影響AMPA受體通道亞型GluA2通道和GluA4通道的脫敏后再恢復(fù)過(guò)程、通道的電流和脫敏的平臺(tái)期電流。結(jié)論:1.AMPA受體和Stargazin之間的靜電吸引力決定了AMPA受體通道亞型GluA2通道的激活和脫敏。2.益智藥奧拉西坦和茴拉西坦盡管都是吡拉西坦的類似物,但其對(duì)AMPA受體的調(diào)節(jié)機(jī)制存在明顯差異。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R96
【圖文】：

圖 6 野生型和突變體 AMPA 受體通道亞型 GluA2 通道去活電流圖(A)和去活時(shí)間常數(shù)統(tǒng)計(jì)圖(B)（***P<0.001）Fig.6 Deactivation currents (A) and the time constants of the deactivation(B) of GluA2 channels in wild type and mutants. ***P<0.001 vs control.

圖 7 野生型和突變體 AMPA 受體通道亞型 GluA2 通道脫敏電流圖(A)和脫敏時(shí)間常數(shù)統(tǒng)計(jì)圖(B)（***P<0.001, ****P<0.0001）Fig.7 Desensitization currents (A) and the time constants of the desensitization(B) of GluA2 channels in wild type and mutants. ***P<0.001,****P<0.0001vs control.

拉西坦組 AMPA 受體通道亞型 GluA4 通程統(tǒng)計(jì)圖（P>0.05）onstants of the recovery of GluA4 channelsGlu and 5 mM oxiracetam. P>0.05 vs contro

【參考文獻(xiàn)】

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1 雷紅梅;孫思源;李麗萍;涂美娟;周慧;曾蘇;蔣惠娣;;穩(wěn)定表達(dá)hMATE1及共表達(dá)hMATE1與hOCT1或hOCT2細(xì)胞模型的構(gòu)建[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2015年07期

2 曠春桃;李湘洲;蔣新元;;吡拉西坦類促智藥的結(jié)構(gòu)修飾及合成研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代化工;2007年S2期

3 金永壽;新促智藥茴拉西坦(Aniracetam)[J];國(guó)外醫(yī)藥.合成藥.生化藥.制劑分冊(cè);1994年06期

本文編號(hào)：2767522