【摘要】：山豆根是最初記載于《開寶本草》的一種中藥,前期對山豆根的研究發(fā)現(xiàn)其中含有Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,而該類型化合物具有一定的抗腫瘤活性。但是Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物在山豆根中的含量較低,且提取收率低,所以如何大量得到該類型化合物已成為當務(wù)之急。本課題對Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物的仿生合成方法進行研究,為該類型化合物的深入研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ),后續(xù)對該類型化合物的抑制腫瘤活性和選擇性進行評價,并對其抗腫瘤機制進行研究,期望發(fā)現(xiàn)新的前體化合物或候選藥物。目的和意義:通過前期工作,我們發(fā)現(xiàn)Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物對乳腺癌細胞的生長具有一定的抑制作用,研究采用仿生合成的方法來構(gòu)建合成路線短、反應(yīng)條件溫和、操作簡單、收率高的合成工藝,并通過體外活性測定方法來評價其抗腫瘤活性,進而對其抗腫瘤機制進行深入研究。研究方法:首先對Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物進行仿生合成,并對合成工藝條件進行優(yōu)化;通過MTT法測定Tonkinensine B對不同腫瘤細胞的抑制活性,計算其IC_(50),確定Tonkinensine B的有效濃度;使用Hoechst33342染色法觀察Tonkinensine B引起MDA-MB-231細胞凋亡的形態(tài)變化;通過細胞流式技術(shù)研究Tonkinensine B促進MDA-MB-231細胞凋亡的作用;使用Western Blot測定MDA-MB-231細胞的內(nèi)源性細胞凋亡途徑中Bcl-2、Bax、Cytochrome C蛋白的表達量,從而確定Tonkinensine B對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞中關(guān)鍵蛋白表達的影響。研究成果:本實驗以N,N-4-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)為催化劑,以(-)-Cytisine和(-)-Maackiain為底物,在HCHO的存在下以溫和方式合成了Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,并通過優(yōu)化反應(yīng)條件,構(gòu)建了較優(yōu)的合成工藝。對(-)-Cytisine、(-)-Maackiain和Tonkinensine B進行體外細胞毒性測定,測定的細胞株包括MCF-7、MDA-MB-231、3LL、9L、Raw264.7、BV2,研究發(fā)現(xiàn)Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物對乳腺癌細胞的生長具有一定的抑制作用,尤其是對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的毒性較明顯(IC_(50)=19.2μM)。Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物對正常的免疫細胞Raw264.7和BV2細胞的毒性數(shù)據(jù)表明該類化合物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有低的細胞毒副作用;細胞流式實驗數(shù)據(jù)表明Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物促進MDA-MB-231細胞凋亡是發(fā)生在細胞凋亡的晚期;Western Blot實驗數(shù)據(jù)表明該類化合物可調(diào)控MDA-MB-231細胞中Bcl-2、Bax、Cytochrome C蛋白的表達。所得結(jié)論:我們用仿生合成的方法將(-)-Cytisine和(-)-Maackiain偶聯(lián)合成Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,該類化合物能夠有效地降低三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的活性,加速細胞的凋亡,并且細胞凋亡是通過線粒體介導的細胞凋亡途徑,其具體機制是通過上調(diào)Bax/Bcl-2蛋白的比值,促進Cytochrome C從線粒體向細胞質(zhì)釋放,最終促進細胞凋亡。學術(shù)意義與應(yīng)用前景:乳腺癌是當今臨床上常見的一種惡性腫瘤,據(jù)統(tǒng)計我國乳腺癌的發(fā)病率已經(jīng)成為女性腫瘤的首位。隨著現(xiàn)代免疫學和細胞分子生物學的快速發(fā)展,人們對乳腺癌細胞凋亡通路中信號的轉(zhuǎn)導有了深入了解,人體通過細胞凋亡這一生理過程能夠有效的抑制腫瘤細胞的生長,因此惡性腫瘤的治療方法主要是以誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡來遏制腫瘤的生長。本課題通過采用仿生合成的方法得到Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,對其抗腫瘤生物活性進行篩選,發(fā)現(xiàn)其對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231具有較為明顯的毒性作用,我們應(yīng)用現(xiàn)代生物學技術(shù)和分子生物學手段,考察Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物對MDA-MB-231細胞的生長抑制作用,探討其促進MDA-MB-21細胞凋亡通路的分子機制,未來有利于闡明乳腺癌的具體發(fā)病機制,為開發(fā)新的乳腺癌治療藥物提供更多的理論依據(jù)。
【學位授予單位】：浙江工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914;R96
【圖文】：

23]，進一步表明金雀花堿在化學合成以及藥物研發(fā)方面的重要性。圖1-1 (-)-Cytisine的化學結(jié)構(gòu)式Figure 1-1. Structures of (-)-Cytisine1.1.3 Pterocarpan 的概述Pterocarpan 屬于異黃酮類化合物，中文名叫“紫檀素”，從 1874 年第一個紫檀素類化合物被分離得到以后，其一直是研究的熱點。(-)-Maackiain 屬于異黃酮類化合物，中文名字為“高麗槐素”，又名馬卡因，其化學結(jié)構(gòu)如圖 1-2。高麗槐素廣泛存在于紅車軸草[25]、牛大力、錦雞兒[26]等植物中，其中紅車軸草是一種全國范圍內(nèi)廣泛分布的天然植物，多分布在草原或綠洲地區(qū)，尤其在新疆地區(qū)最為常見。通過對文獻的收集整理發(fā)現(xiàn)，高麗槐素能夠有效地抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和谷草芽孢桿菌的分裂生長，具有很好的抗真菌和抗細菌功效[27]

進一步表明紫檀類化合物在藥物研發(fā)方面的重要性。圖1-2 (-)-Maackiain的化學結(jié)構(gòu)式Figure 1-2. Structures of (-)-Maackiain1.1.4 Cytisine-Pterocarpan 新骨架化合物的概述(-)-Cytisine 和 Pterocarpan 這兩種類型的化合物在藥物研發(fā)領(lǐng)域一直為研究者所關(guān)注，但是具有 Cytisine-Pterocarpan 偶聯(lián)骨架的化合物還是首次被發(fā)現(xiàn)[38]。其中 具 有 Cytisine-Pterocarpan 新 骨 架 化 合物 的 兩 個 化 合 物 Tonkinensine A 和Tonkinensine B 是山豆根中含量較低的化合物，前期對它們的抗腫瘤活性進行了初步的研究，發(fā)現(xiàn) Tonkinensine B 對人類宮頸癌 HeLa 細胞和人三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細胞具有一定的生長抑制作用，所以有必要對具有該新骨架類型化合物的發(fā)現(xiàn)、合成以及生物活性進行深入的研究。圖1-3 Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物的化學結(jié)構(gòu)式Figure 1-3. Structures of Cytisine-Pterocarpan derived compounds1.2 研究目的隨著對中藥成分的活性篩選、細胞分子生物學等技術(shù)的不斷深入研究，從自然界常見的植物中研究開發(fā)出高效低毒的腫瘤治療藥物或先導化合物已經(jīng)成為開展新型抗癌藥物的一個重要的途徑。自然界中存在的植物種類多樣，來源不同的植物其所含的成分也存在很大的差異，該性質(zhì)造成了不同天然植物中有效成分的千差萬別

圖1-2 (-)-Maackiain的化學結(jié)構(gòu)式Figure 1-2. Structures of (-)-Maackiain1.1.4 Cytisine-Pterocarpan 新骨架化合物的概述(-)-Cytisine 和 Pterocarpan 這兩種類型的化合物在藥物研發(fā)領(lǐng)域一直為研究者所關(guān)注，但是具有 Cytisine-Pterocarpan 偶聯(lián)骨架的化合物還是首次被發(fā)現(xiàn)[38]。其中 具 有 Cytisine-Pterocarpan 新 骨 架 化 合物 的 兩 個 化 合 物 Tonkinensine A 和Tonkinensine B 是山豆根中含量較低的化合物，前期對它們的抗腫瘤活性進行了初步的研究，發(fā)現(xiàn) Tonkinensine B 對人類宮頸癌 HeLa 細胞和人三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細胞具有一定的生長抑制作用，所以有必要對具有該新骨架類型化合物的發(fā)現(xiàn)、合成以及生物活性進行深入的研究。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2762397