【摘要】：冠狀動(dòng)脈血流量降低,心肌血液供應(yīng)受阻,導(dǎo)致心肌缺血,使心肌細(xì)胞供氧不足和代謝產(chǎn)物清除減少,造成心臟功能障礙甚至心肌細(xì)胞死亡。缺血后的血流恢復(fù)或輸血反而可能加重心肌組織結(jié)構(gòu)和功能破壞、甚至發(fā)生不可逆性損傷,造成心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)。鈣超載和活性氧增多引起的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、心肌纖維化與凋亡是MIRI主要的發(fā)病機(jī)制,研究改善這些病因的藥物對(duì)抗MIRI具有積極的臨床意義�？Х人岜揭阴�(CAPE)是提取自蜂膠中的一種活性成分,屬類黃酮類,有較好的抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤等藥理活性。有報(bào)道類黃酮類物質(zhì)如姜黃素可以通過(guò)上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)的表達(dá),增加抗氧化能力起到改善MIRI作用,而同屬黃酮類的CAPE是否能夠激活SIRT1還未見(jiàn)報(bào)道。本課題組在CAPE的苯環(huán)對(duì)位引入硝基合成的咖啡酸對(duì)硝基苯乙酯(CAPE-pNO_2)具有更強(qiáng)的促巨噬細(xì)胞的吞噬、抗血小板聚集、改善MIRI與糖尿病腎病損傷的作用。前期的研究表明硝基引入能增加MIRI的心肌組織中NO的含量,增加的NO是由硝基取代化合物直接代謝還是通過(guò)上調(diào)一氧化氮合酶(eNOS)加速生成而來(lái)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。本試驗(yàn)首次合成了CAPE的鄰位硝基取代物——咖啡酸鄰硝基苯乙酯(CAPE-oNO_2),并申報(bào)獲得了中國(guó)發(fā)明專利。SYBYL模擬發(fā)現(xiàn),鄰位取代較對(duì)位取代具有更高的溶解度和更低的臟器毒性。本文選擇CAPE-oNO_2通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討其對(duì)大鼠急性MIRI的作用及其可能的作用機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):結(jié)扎SD大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支造成心肌缺血,缺血30 min后再灌注2 h建立急性MIRI模型。結(jié)扎前30 min尾靜脈注射給予SIRT1抑制劑煙酰胺(NAM)或eNOS抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME),而藥物或溶劑(Vehicle)在結(jié)扎前15 min給予。將大鼠隨機(jī)分為8組:空白對(duì)照(Control)組,缺血再灌注(IR)組,CAPE(0.1 mg/kg)組,CAPE-oNO_2(0.1 mg/kg)組,NAM(1 mg/kg)+Vehicle組,NAM(1 mg/kg)+CAPE-oNO_2(0.1 mg/kg)組,L-NAME(1 mg/kg)+Vehicle組,L-NAME(1 mg/kg)+CAPE-oNO_2(0.1 mg/kg)組。首先通過(guò)TTC、HE、免疫組化和天狼星紅染色分別測(cè)定心肌梗死面積、心臟組織病理學(xué)變化、心臟組織中TNF-α表達(dá)和膠原含量,再用試劑盒測(cè)定血清中心肌酶(HBDH,LDH,CK,CK-MB和IMA)水平與心臟組織中t-SOD、MDA、MPO、NO含量,然后通過(guò)免疫印跡(Western blot)法分析心肌組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)。最后通過(guò)LC-MS方法分析CAPE和CAPE-oNO_2在MIRI大鼠心肌組織中的代謝情況。結(jié)果表明,CAPE和CAPE-oNO_2均可降低心肌梗死面積,改善缺血引起的心肌細(xì)胞排列紊亂,炎性細(xì)胞聚集等現(xiàn)象,并且能夠顯著降低心肌酶、MDA、MPO含量,TNF-α表達(dá)和膠原沉積,增加t-SOD活性和NO含量(P0.05)。兩者均可上調(diào)SIRT1和eNOS的表達(dá),從而影響下游信號(hào)通路NF-κB,通過(guò)激活PGC-1α/Nrf2/SOD1系統(tǒng)緩解氧化應(yīng)激;通過(guò)抑制IκB和P65磷酸化,下調(diào)TNF-α與IL-6表達(dá),減少心肌組織炎癥反應(yīng);通過(guò)下調(diào)TGF-β1,p-Smad2/3和Collagen的表達(dá),減少心肌膠原沉積;通過(guò)上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的表達(dá),減少心肌細(xì)胞的凋亡。值得注意的是CAPE-oNO_2在抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、抗纖維化和抗凋亡方面均表現(xiàn)出較CAPE更強(qiáng)的作用(P0.05),而當(dāng)給予抑制劑后CAPE-oNO_2改善MIRI的作用被明顯抑制。二者的代謝產(chǎn)物與代謝方式均存在明顯差異,CAPE-oNO_2具有脫硝基代謝方式。細(xì)胞實(shí)驗(yàn),采用氧糖剝奪的培養(yǎng)方法誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞缺氧,2h后正常條件下培養(yǎng)4h以復(fù)氧,建立細(xì)胞層面的MIRI模型。抑制劑在缺氧初期給予而藥物或溶劑在復(fù)氧初期給予。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞分為10組:Control組,缺氧/復(fù)氧(HR)模型組,CAPE(10,20,40μM)組,CAPE-oNO_2(10,20,40μM)組,NAM(40μM)+CAPE-oNO_2(40μM)組,L-NAME(40μM)+CAPE-oNO_2(40μM)組。通過(guò)噻唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)測(cè)定心肌細(xì)胞的存活率,AO染色和ROS染色分別考察細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果顯示,HR處理后心肌細(xì)胞存活率明顯降低(P0.05),而給予CAPE和CAPE-oNO_2能有效提高細(xì)胞存活率,減少HR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和ROS產(chǎn)生,并且呈現(xiàn)劑量依賴性。Western blot結(jié)果顯示CAPE和CAPE-oNO_2組較HR組的SIRT1,eNOS,PGC-1α,SOD1和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加,而p-IκB/IκB,p-P65/P65和Bax明顯降低(P0.05)。同樣地,在細(xì)胞層面CAPE-oNO_2仍然表現(xiàn)出比CAPE更強(qiáng)抗MIRI的作用,而抑制劑的存在則一定程度上削弱了CAPE-oNO_2的作用。動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均顯示,CAPE和CAPE-oNO_2能夠有效緩解MIRI,可能成為臨床改善和預(yù)防心肌損傷的候選藥物。其作用機(jī)制可能為增加SIRT1和eNOS蛋白表達(dá),影響NF-κB下游信號(hào)通路,產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng),抗?jié)撛诶w維化和抗凋亡的作用,通過(guò)多向調(diào)節(jié)發(fā)揮心肌保護(hù)作用。硝基取代能夠明顯提高CAPE的抗MIRI活性,其原因可能在于更大程度地上調(diào)SIRT1和eNOS從而影響NO含量并可能通過(guò)直接脫硝基代謝出NO,CAPE和CAPE-oNO_2在心臟組織中的不同代謝產(chǎn)物與方式也可能是CAPE-oNO_2效果優(yōu)于CAPE的原因之一。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R965
【圖文】：

第 1 章 文獻(xiàn)綜述方面由于纖維化心肌組織的電傳導(dǎo)異常阻礙了心肌細(xì)胞對(duì)氧的攝取，可惡性心律失常的發(fā)生，甚至猝死[12]。ROS 是心肌纖維化形成與發(fā)展的關(guān)研究表明，ROS 在心臟成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成和細(xì)胞外基質(zhì)代謝過(guò)要作用。正常情況下，心肌間質(zhì)膠原處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以此來(lái)保持細(xì)的穩(wěn)定。ROS 可通過(guò)使細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解增加，從而激活基質(zhì)金屬（MMP-2）和 MMP-9 等途徑，調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增生，促進(jìn) MF。此外 R通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，介導(dǎo)心肌細(xì)胞的肥大、凋亡，同時(shí)通過(guò)滅活 N血管內(nèi)皮功能的紊亂，進(jìn)而誘發(fā)或加重 MF 的發(fā)生[13]。

圖 3.1 CAPE，CAPE-pNO2和 CAPE-oNO2的結(jié)構(gòu)式Fig 3.1 The chemical structure of CAPE，CAPE-pNO2and CAPE-oNO2.3.2.2 合成方法咖啡酸鄰硝基苯乙酯合成路線如圖 3.2 所示。將咖啡酸 0.9 g（5.0 mmol，Ⅰ）和二氯亞砜 20 ml 置 100 ml 圓底燒瓶中，混勻，升溫至 80 ℃回流反應(yīng)，待反應(yīng)液變?yōu)槌吻搴�，減壓蒸餾除去剩余的二氯亞砜，得到乳白色固體咖啡酸酰氯（Ⅱ），加入無(wú)水二氯甲烷（氫化鈣干燥）20 ml 使溶解，在室溫條件下滴加鄰硝基苯乙醇0.8 g（4.8 mmol，Ⅲ）的二氯甲烷溶液 20 ml，混合均勻后，再滴加三乙胺 0.4 ml（2.9 mmol），升溫至 50 ℃回流反應(yīng)，用薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液減壓蒸餾除去溶劑得到淺黃棕色粘稠液體，用適量無(wú)水丙酮溶解后，加入 80-100 目硅膠攪拌混勻，再減壓蒸餾除去丙酮后，用柱層析（硅膠 200-300 目）分離純化，干法上樣，丙酮-石油醚（體積比 1:3）混合溶劑為洗脫劑，收集洗脫液，真空旋蒸干燥，得棕褐色固體，用丙酮-石油醚混合溶劑重結(jié)晶，得淺黃棕色晶體。

21圖 3.3 高效液相色譜法結(jié)果Fig 3.3 The results of HPLC. (A)The HPLC results of caffee acid. (B) The HPLC results ofo-nitrophenylethanol. (C) The HPLC results of CAPE-oNO2.(D) The HPLC results of CAPE.3.3.5 液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜咖啡酸鄰硝基苯乙酯的質(zhì)譜（圖 3.4）為：LC-MS m/z (%):328.0724[M-H] + (calc.C17H15NO6: 329.02)。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2761523