發(fā)布時間：2020-07-18 16:42

【摘要】：研究目的:設計一種集靶向、酶敏感和穿膜等多種功能于一體的多功能抗炎肽,利用固相合成法合成該肽,并通過體外細胞和體內(nèi)動物實驗來對其抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的活性進行評價。研究方法:采用固相合成法,按照四種多肽,即RMTQ、TATQ、QAW和RMT的氨基酸順序,從C端到N端依次進行合成。利用高效液相色譜(HPLC)對合成多肽的純度以及利用質(zhì)譜(MS)對多肽的分子量進行分析;通過圓二色譜儀檢查各組多肽的圓二色性,并對其二級結(jié)構(gòu)進行判斷;利用Tricine-SDS-PAGE電泳對靶向抗炎多肽的體外酶切實驗進行考察;通過CCK-8法對各組多肽對單核巨噬細胞Raw264.7的毒性進行考察;利用脂多糖(LPS)刺激Raw264.7細胞以建立體外細胞炎癥模型,細胞上清中的炎癥因子IL-6和TNF-α用ELISA試劑盒進行檢測;利用試劑盒定量檢測細胞內(nèi)一氧化氮含量,通過熒光顯微鏡檢測細胞內(nèi)熒光強度來定性檢測活性氧含量;利用流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡對各組多肽的細胞攝取量分別進行定量和定性的檢測和觀察;利用熒光探針標記溶酶體的位置,通過激光共聚焦顯微鏡判斷靶向抗炎多肽的溶酶體逃逸情況;通過給小鼠注射完全弗氏佐劑以建立動物炎癥模型,建模成功后連續(xù)給藥14天,與抗炎藥物地塞米松,游離多肽QAW、無靶向作用的多肽TATQ和無抗炎活性的多肽RMT進行對比,通過對小鼠的體重、足趾體積、臨床關(guān)節(jié)評分、血清中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量以及對踝關(guān)節(jié)腔組織切片的觀察等指標的研究,對靶向抗炎多功能肽的體內(nèi)抗炎活性進行初步評價。研究結(jié)果:質(zhì)譜和高效液相結(jié)果表明利用固相合成法合成的多肽分子量正確且純度能達到98%以上;圓二色譜結(jié)果顯示除了多肽QAW外,其余三種多肽在室溫下水溶液中均為無規(guī)則構(gòu)象;體外酶切實驗中,Tricine-SDS-PAGE結(jié)果表明靶向抗炎多肽中的酶敏感肽鏈能被type IV collagenase特異性地剪切。在細胞實驗中,CCK-8結(jié)果表明各組多肽濃度在不高于30μM時,對Raw264.7細胞的毒性都小于10%;ELISA結(jié)果表明,與LPS刺激組、游離多肽QAW組、非靶向TATQ多肽組和無抗炎活性肽RMT組相比,靶向抗炎肽能更有效地降低炎癥細胞中炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌,但治療效果并不與濃度成正比;在一氧化氮含量的檢測中,與其他組相比較,靶向抗炎多肽能顯著降低NO的含量;活性氧的定性檢測中,靶向抗炎多肽組治療后活性氧的熒光強度明顯低于其他組,但與地塞米松治療組相當;利用激光共聚焦顯微鏡對細胞的定性攝取情況的檢查結(jié)果中,給藥1 h時,RMTQ組與TATQ組熒光強度相似,2 h和4 h時,RMTQ組熒光強度漸漸高于TATQ組,且在三個時間點均強于游離抗炎肽QAW,并與流式細胞結(jié)果相一致;在對多肽溶酶體逃逸的研究中發(fā)現(xiàn)含有穿膜肽的RMTQ組和TATQ組游離溶酶體外的熒光強度明顯強于QAW組。動物實驗中,與游離抗炎多肽QAW相比,靶向抗炎多肽能更好地降低小鼠炎癥關(guān)節(jié)的腫脹、臨床評分及血清中炎癥因子的水平,且血液中各種血細胞的含量也更接近于正常組。給藥治療后,各組小鼠的體重都有所增加。實驗結(jié)論:本實驗所設計的多功能靶向抗炎多肽能增加細胞攝取率,提高游離抗炎肽QAW的體內(nèi)外抗炎活性,具有顯著的抗類風濕性關(guān)節(jié)炎活性和很好的臨床治療前景。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914;R96
【圖文】：

圖 1.1 NF-κB 信號通路Figure1.1 NF-κB signaling pathway肽代，E. Ruoslahti 首次發(fā)現(xiàn)了 RGD 序列（Arg-G細胞附著位點[38]。后來，該序列被認為是天然許多天然蛋白中，如纖維蛋白原，纖連蛋白，應蛋白，凝血酶原，MMP-2，層粘連蛋白，骨合素αvβ3結(jié)合[40-42]。在許多腫瘤細胞，血管內(nèi)皮整合素αvβ3，因此利用 RGD 肽能特異性地結(jié)合的納米藥物載體主動地靶向到癌癥或炎癥部位[4系統(tǒng)而言，靶向制劑最潛在的優(yōu)勢就是能增加向肽連接的載體而言，載體將藥物遞送到靶部位

靶向抗炎多肽的結(jié)構(gòu)及其作用機制圖

16圖 2.1 合成的各多肽的高效液相色譜圖（譜圖由多肽合成公司提供）（A：RMTQ；B：TATQ；C：QAW；D：RMT）.1 HPLC results of each peptide synthesized by the company (A: RMTQ; B: TAQAW; D: RMT)

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本文編號：2761154