【摘要】：研究目的:設(shè)計(jì)一種集靶向、酶敏感和穿膜等多種功能于一體的多功能抗炎肽,利用固相合成法合成該肽,并通過(guò)體外細(xì)胞和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)其抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究方法:采用固相合成法,按照四種多肽,即RMTQ、TATQ、QAW和RMT的氨基酸順序,從C端到N端依次進(jìn)行合成。利用高效液相色譜(HPLC)對(duì)合成多肽的純度以及利用質(zhì)譜(MS)對(duì)多肽的分子量進(jìn)行分析;通過(guò)圓二色譜儀檢查各組多肽的圓二色性,并對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行判斷;利用Tricine-SDS-PAGE電泳對(duì)靶向抗炎多肽的體外酶切實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察;通過(guò)CCK-8法對(duì)各組多肽對(duì)單核巨噬細(xì)胞Raw264.7的毒性進(jìn)行考察;利用脂多糖(LPS)刺激Raw264.7細(xì)胞以建立體外細(xì)胞炎癥模型,細(xì)胞上清中的炎癥因子IL-6和TNF-α用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè);利用試劑盒定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)一氧化氮含量,通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度來(lái)定性檢測(cè)活性氧含量;利用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡對(duì)各組多肽的細(xì)胞攝取量分別進(jìn)行定量和定性的檢測(cè)和觀(guān)察;利用熒光探針標(biāo)記溶酶體的位置,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡判斷靶向抗炎多肽的溶酶體逃逸情況;通過(guò)給小鼠注射完全弗氏佐劑以建立動(dòng)物炎癥模型,建模成功后連續(xù)給藥14天,與抗炎藥物地塞米松,游離多肽QAW、無(wú)靶向作用的多肽TATQ和無(wú)抗炎活性的多肽RMT進(jìn)行對(duì)比,通過(guò)對(duì)小鼠的體重、足趾體積、臨床關(guān)節(jié)評(píng)分、血清中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量以及對(duì)踝關(guān)節(jié)腔組織切片的觀(guān)察等指標(biāo)的研究,對(duì)靶向抗炎多功能肽的體內(nèi)抗炎活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。研究結(jié)果:質(zhì)譜和高效液相結(jié)果表明利用固相合成法合成的多肽分子量正確且純度能達(dá)到98%以上;圓二色譜結(jié)果顯示除了多肽QAW外,其余三種多肽在室溫下水溶液中均為無(wú)規(guī)則構(gòu)象;體外酶切實(shí)驗(yàn)中,Tricine-SDS-PAGE結(jié)果表明靶向抗炎多肽中的酶敏感肽鏈能被type IV collagenase特異性地剪切。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,CCK-8結(jié)果表明各組多肽濃度在不高于30μM時(shí),對(duì)Raw264.7細(xì)胞的毒性都小于10%;ELISA結(jié)果表明,與LPS刺激組、游離多肽QAW組、非靶向TATQ多肽組和無(wú)抗炎活性肽RMT組相比,靶向抗炎肽能更有效地降低炎癥細(xì)胞中炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌,但治療效果并不與濃度成正比;在一氧化氮含量的檢測(cè)中,與其他組相比較,靶向抗炎多肽能顯著降低NO的含量;活性氧的定性檢測(cè)中,靶向抗炎多肽組治療后活性氧的熒光強(qiáng)度明顯低于其他組,但與地塞米松治療組相當(dāng);利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞的定性攝取情況的檢查結(jié)果中,給藥1 h時(shí),RMTQ組與TATQ組熒光強(qiáng)度相似,2 h和4 h時(shí),RMTQ組熒光強(qiáng)度漸漸高于TATQ組,且在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均強(qiáng)于游離抗炎肽QAW,并與流式細(xì)胞結(jié)果相一致;在對(duì)多肽溶酶體逃逸的研究中發(fā)現(xiàn)含有穿膜肽的RMTQ組和TATQ組游離溶酶體外的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于QAW組。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,與游離抗炎多肽QAW相比,靶向抗炎多肽能更好地降低小鼠炎癥關(guān)節(jié)的腫脹、臨床評(píng)分及血清中炎癥因子的水平,且血液中各種血細(xì)胞的含量也更接近于正常組。給藥治療后,各組小鼠的體重都有所增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的多功能靶向抗炎多肽能增加細(xì)胞攝取率,提高游離抗炎肽QAW的體內(nèi)外抗炎活性,具有顯著的抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性和很好的臨床治療前景。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R914;R96
【圖文】：

圖 1.1 NF-κB 信號(hào)通路Figure1.1 NF-κB signaling pathway肽代，E. Ruoslahti 首次發(fā)現(xiàn)了 RGD 序列（Arg-G細(xì)胞附著位點(diǎn)[38]。后來(lái)，該序列被認(rèn)為是天然許多天然蛋白中，如纖維蛋白原，纖連蛋白，應(yīng)蛋白，凝血酶原，MMP-2，層粘連蛋白，骨合素αvβ3結(jié)合[40-42]。在許多腫瘤細(xì)胞，血管內(nèi)皮整合素αvβ3，因此利用 RGD 肽能特異性地結(jié)合的納米藥物載體主動(dòng)地靶向到癌癥或炎癥部位[4系統(tǒng)而言，靶向制劑最潛在的優(yōu)勢(shì)就是能增加向肽連接的載體而言，載體將藥物遞送到靶部位

靶向抗炎多肽的結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制圖

16圖 2.1 合成的各多肽的高效液相色譜圖（譜圖由多肽合成公司提供）（A：RMTQ；B：TATQ；C：QAW；D：RMT）.1 HPLC results of each peptide synthesized by the company (A: RMTQ; B: TAQAW; D: RMT)

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本文編號(hào)：2761154