【摘要】：硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate,CS)是由葡萄糖醛酸及N-乙酰半乳糖胺重復(fù)二糖單元組成的一種酸性鏈狀多糖,廣泛分布于動物組織的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞膜表面,主要以蛋白聚糖(PG)的形式存在。研究發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、心腦血管保護(hù)、抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、抗腫瘤等多種重要生物活性,且長期服用毒副作用小,可以作為保健品和藥品廣泛使用。目前硫酸軟骨素的來源主要是動物軟骨組織提取,不同動物組織提取的硫酸軟骨素存在分子大小及硫酸化程度差異,且動物提取存在成本高,產(chǎn)量低,環(huán)境污染等缺點,希望通過生物化學(xué)法合成硫酸化程度及分子量可控的硫酸軟骨素類似物。大腸桿菌K4莢膜多糖(Escherichia coli K4 polysaccharide,K4)糖鏈結(jié)構(gòu)為葡萄糖醛酸與N-乙酰半乳糖胺組成的重復(fù)二糖單元,在葡萄糖醛酸C-3上有一個果糖側(cè)鏈,其與硫酸軟骨素具有相同的碳鏈骨架,可以作為合成硫酸軟骨素的前體,本研究通過高密度發(fā)酵,對K4多糖發(fā)酵液進(jìn)行分離純化,得到純品K4。對K4通過溫和的酸水解,去除果糖側(cè)鏈,得到軟骨素類似物去果糖K4(defructosylated K4,K4de),通過NMR、IR、SEC-MALLS、HPLC等手段對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。對得到的K4及K4de,使用對巨噬細(xì)胞系研究其的體外免疫調(diào)節(jié)活性,開發(fā)其作為天然的免疫增強(qiáng)劑的潛能。同時對得到的K4de進(jìn)行不同程度的硫酸化硫酸化,并對硫酸化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,研究其硫酸化產(chǎn)物的生理活性。研究結(jié)果如下:(1)通過高密度生物發(fā)酵發(fā)酵得到K4de,發(fā)酵液中糖醛酸產(chǎn)量達(dá)790 mg/L。采用乙醇沉淀法及savage脫蛋白、陰離子交換色譜等方法純化,得到的K4純度較高。通過核磁共振及紅外對所得K4進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,通過SEC-MALLS測定其M_w=6.49?10~4,多分散指數(shù)PDI為1.05。(2)將不同濃度的K4及去K4de作用于RAW264.7(巨噬細(xì)胞),結(jié)果表明,K4及K4de對巨噬細(xì)胞具有免疫增強(qiáng)活性,能激活巨噬細(xì)胞,伸出偽足,刺激巨噬細(xì)胞增殖,使NO和相關(guān)炎性因子分泌增加,且具有濃度依賴性。(3)通過化學(xué)法對分子量為12 kDa的K4de進(jìn)行降解,制備分子量為3 kDa的L-K4de(低分子量K4de),分別對其進(jìn)行硫酸化,制備了非定點硫酸化的衍生物K4deOS(H)、K4de-NS、K4de-ONS,及高低兩種分子量定點硫酸化的衍生物,分別為K4de-4OS、K4de-6OS、K4de-4.6OS、L-K4de-4OS、L-K4de-6OS、L-K4de-4.6OS,均通過SEC-MALLS測定分子量。并通過瓊脂糖凝膠電泳及元素分析表明考察其硫酸化程度,以軟骨素酶ABC對硫酸化產(chǎn)物進(jìn)行酶解,通過HPLC對其進(jìn)行二糖分析。(4)制備低分子量低程度硫酸化的L-K4deOS(L),作用于CIA模型的關(guān)節(jié)炎小鼠,考察對小鼠關(guān)節(jié)炎作用的影響。實驗小鼠口服L-K4deOS(L)8周后,與模型組相比,小鼠發(fā)病晚,多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)低,且長期服用,小鼠無明顯其他不良反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R914;R96
【圖文】：

Chondroitin sulfate，CS）是一種廣泛存在于人類的酸性黏多糖，分布于細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞膜表面CS 糖鏈結(jié)構(gòu)是由葡萄糖醛酸（GlcA）和和 N-乙酰成二糖單元，重復(fù)二糖單元再以 β-1，4 糖苷鍵酸基團(tuán)取代，形成不同種類的硫酸軟骨素，CS-A、硫酸軟骨素二糖單元如圖 1-1，其中，CS-A 是 G代，CS-B 是 GlcA 上 2 位 C 和 GalNAc 上 4 位 CalNAc 上 6 位 C 上的-OH 被取代，CS-D 是 GlcA被硫酸基團(tuán)取代，而 CS-E 是指 GalNAc 上 4 位和。硫酸軟骨素的分子量一般因為其來源的不同，的硫酸軟骨素一般為 CS-C，分子大小為 20~25更大，分子量為 50~80 kDa。然而，即使是單一也不均一。此外，CS 的組成和濃度還與來源的洋生物的硫酸軟骨素含有不同糖鏈長度和硫酸化蛙魚中提取的位 CS-E,從雞中提取的主要為 CS-

圖 2-1 野生型大腸桿菌 K4 發(fā)酵曲線Fig.2-1 Wild-type E. coli K4 fermentation curve交換色譜法是利用多糖的帶電性質(zhì)不同的將多糖進(jìn)行分離的方法,K過離子交換色譜法進(jìn)行進(jìn)一步分離。K4 粗品使用 AKTA-prime 進(jìn)行收進(jìn)行信號采集，洗脫曲線如圖 2 所示。純化過程采用 buffer B 從 0 緩慢洗脫，粗糖分為組分有兩個，洗脫峰 1 出峰位置在 buffer B 濃度%，洗脫峰 2 出峰位置在 buffer B 濃度為 50 %~62 %，洗脫峰 2 的組洗脫峰1，分別取兩個組分通過紫外吸收光譜進(jìn)行鑒別，洗脫峰2在2紫外吸收，應(yīng)該是粗純化過程中少量殘留的蛋白或者核酸 K4 為第一對兩個組分進(jìn)行核磁進(jìn)一步鑒定。

圖 2-1 野生型大腸桿菌 K4 發(fā)酵曲線Fig.2-1 Wild-type E. coli K4 fermentation curve交換色譜法是利用多糖的帶電性質(zhì)不同的將多糖進(jìn)行分離的方法,K過離子交換色譜法進(jìn)行進(jìn)一步分離。K4 粗品使用 AKTA-prime 進(jìn)行收進(jìn)行信號采集，洗脫曲線如圖 2 所示。純化過程采用 buffer B 從 0 緩慢洗脫，粗糖分為組分有兩個，洗脫峰 1 出峰位置在 buffer B 濃度%，洗脫峰 2 出峰位置在 buffer B 濃度為 50 %~62 %，洗脫峰 2 的組洗脫峰1，分別取兩個組分通過紫外吸收光譜進(jìn)行鑒別，洗脫峰2在2紫外吸收，應(yīng)該是粗純化過程中少量殘留的蛋白或者核酸 K4 為第一對兩個組分進(jìn)行核磁進(jìn)一步鑒定。

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