【摘要】：腫瘤是當(dāng)今時代威脅人類健康的重大疾病,每年都有大量病人死于癌癥。在所有癌癥中,肺癌是發(fā)病率和死亡率都非常高的一種,且由于發(fā)病原因和病理特征的復(fù)雜性,目前為止,針對肺癌的預(yù)防和治療,尚未有特效藥。因此,尋找高效低毒的抗腫瘤特別是抗肺癌的藥物迫在眉睫。海洋中有豐富的微生物資源,這些微生物能產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新型,生物活性強(qiáng)的天然產(chǎn)物,這些天然產(chǎn)物與陸源天然產(chǎn)物有很大差別,為未來新藥的研發(fā)提供了有效充足的先導(dǎo)化合物。海洋生物多糖是近年來研究的熱點(diǎn),在抗炎癥抗病毒抗腫瘤等多方面顯示出良好的生物活性,此外,海洋生物多糖還廣泛應(yīng)用于食品化妝品以及輔助醫(yī)療等方面,表明海洋生物多糖具有良好的生物安全性。因此,近年來,以海洋多糖為基礎(chǔ)的抗腫瘤藥物研發(fā)吸引了越來越多人的關(guān)注。本研究從一株海洋芽孢桿菌中分離得到一種新型胞外多糖EPS11,并對該多糖的性質(zhì)結(jié)構(gòu)抗腫瘤活性和抗腫瘤機(jī)理進(jìn)行了初步探究。研究表明,EPS11為一種雜多糖,重均分子量為22.3 kDa。單糖組成分析的結(jié)果表明,EPS11由甘露糖,氨基葡萄糖,鼠李糖,半乳糖醛酸,葡萄糖和木糖組成,其摩爾比為1:2.58:0.68:0.13:3.09:1.41。EPS11具有明顯的癌細(xì)胞毒性,且對肺癌細(xì)胞作用尤為顯著。當(dāng)給藥濃度為90 nmol/L時,在作用48 h的情況下,EPS11對A549、H1299和H460細(xì)胞的抑制率分別高達(dá)80%,67%和47%。在對EPS11抑癌機(jī)理的探究中,我們發(fā)現(xiàn)EPS11能顯著抑制多種肺癌細(xì)胞的黏附,蛋白質(zhì)組學(xué)的研究也表明,EPS11能下調(diào)細(xì)胞中多種黏附相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)。掃描電鏡的結(jié)果進(jìn)一步證明,EPS11的處理能破壞多種肺癌細(xì)胞表面的突出結(jié)構(gòu)。且胞外突出結(jié)構(gòu)的破壞程度與細(xì)胞的黏附能力表現(xiàn)出一定的正相關(guān)性,這表明這一結(jié)構(gòu)在細(xì)胞的黏附過程中起非常重要的作用。一般細(xì)胞與基質(zhì)之間失去黏附后會發(fā)生失巢凋亡,而部分癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗是其轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。而本研究中,EPS11不僅影響細(xì)胞的黏附還抑制A549細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗。βⅢ-Tubulin是肺癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡的關(guān)鍵蛋白。本研究證明,EPS11能時間和劑量依賴地抑制βⅢ-Tubulin相關(guān)的細(xì)胞通路。其具體表現(xiàn)為,(1)EPS11在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上抑制了βⅢ-tubulin的表達(dá);(2)EPS11降低了βⅢ-Tubulin下游AKT的活化。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,EPS11也顯示出良好的抑瘤活性,在2.24μmol/kg/2d的給藥條件下能顯著抑制小鼠體內(nèi)A549細(xì)胞移植瘤的生長,抑瘤率為42.2%,同時無明顯副作用。綜上所述,我們認(rèn)為EPS11通過破壞黏附相關(guān)的蛋白和結(jié)構(gòu)抑制癌細(xì)胞的黏附,同時通過抑制βⅢ-Tubulin介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抵抗來誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。這表明EPS11可能是一種有潛力的靶肺癌治療的天然產(chǎn)物。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R915
【圖文】：

共發(fā)現(xiàn)19株菌的胞外多活性提物對Huh7.5細(xì)胞有明顯的抑制作用（圖3.1）。其中，編號為 BS11 的一株菌抑制率最高，其原始胞外活性粗提物作用 24h 后對 Huh7.5 的抑制率超過 90%。圖 3.1 不同海洋細(xì)菌胞外活性粗提物對 Huh7.5 細(xì)胞生長的抑制Figure 3.1 Cytotoxic effects of crude extract from different marine bacteria on Huh7.5 cellline用 BS11 的胞外粗提物處理 Huh7.5 細(xì)胞 8 小時后，細(xì)胞即出現(xiàn)凝集和漂浮的現(xiàn)象。在顯微鏡下觀察，經(jīng) BS11 胞外粗提物處理的 Huh7.5 的形態(tài)發(fā)生明顯變化（圖 3.2A）。用該產(chǎn)物處理 A549 細(xì)胞同樣可以觀察到細(xì)胞形態(tài)的明顯變化（圖 3.2 B）。

3.2 經(jīng) BS11 胞外粗提物處理后（A）Huh7.5 細(xì)胞形態(tài)的變化 （B）A549 細(xì)胞形態(tài)的變化Figure 3.2 Changes of cell morphology on (A) Huh7.5 and (B) A549 cell lines after crudeextract from BS11 treatment平板劃線分離得到 BS11 的單菌落，菌落呈橘黃色，表面略粗糙。提取 BS11株的基因組，用通用引物對該菌的 16S rDNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序。所得序列 NCBI 網(wǎng)站上用 BLAST 程序進(jìn)行比對，并構(gòu)建進(jìn)化樹（圖 3.3）。比對結(jié)果顯示，BS11 與多株芽孢桿菌親緣關(guān)系較近，且其中多株芽孢桿菌精確鑒定到種，結(jié)合菌落形態(tài)，初步將 BS11 鑒定為 Bacillus sp.。BS11 的 16SDNA 序列信息已上傳 NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫，其相應(yīng)的 GenBank 序列號為：G597178。

圖 3.3 芽孢桿菌 Bacillus sp. 11 的 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Figure 3.3 Phylogenetic tree of Bacillus sp. 11 based on 16S rDNA sequence3.2 活性物質(zhì)的發(fā)酵優(yōu)化及性質(zhì)確定3.2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化對芽孢桿菌 Bacillus sp.11 的液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以 2216E 培養(yǎng)基外加1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同種類的糖（葡萄糖、果糖、木糖、鼠李糖、麥芽糖、半乳糖、糊精、可溶淀粉、甘油、蔗糖、乳糖）（圖 3.4），不同氮源、不同培養(yǎng)時間、不同發(fā)酵體積進(jìn)行條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。通過 MTT 發(fā)對發(fā)酵液的粗提物進(jìn)行活性檢測。初步實(shí)驗(yàn)表明，外加氮源和改變培養(yǎng)時間均不能明顯促進(jìn)活性物質(zhì)的產(chǎn)生。在 2216E 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上外加糖對發(fā)酵物活性的提升最明顯，其次發(fā)酵時間也

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 盧今;伍長娟;陳禮明;楊肖琳;金涌;;國產(chǎn)與進(jìn)口紫杉醇注射液在小鼠體內(nèi)藥動學(xué)比較[J];中國醫(yī)院藥學(xué)雜志;2010年16期

2 周慶峰;李明月;那廣水;李成偉;;海洋生物多糖抗腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J];中國藥理學(xué)通報;2009年08期

3 吳梧桐,王友同,吳文俊;海洋活性物質(zhì)研究若干進(jìn)展[J];藥物生物技術(shù);2000年03期

4 管華詩,耿美玉,王長云;21世紀(jì),中國的海洋藥物[J];中國海洋藥物;2000年04期

本文編號：2757465