【摘要】：目的:表皮生長因子(EGFR)作為ErbB家族的成員之一,是細(xì)胞受體中研究最多的細(xì)胞信號(hào)受體之一。作為第一個(gè)被鑒定為蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶的受體,EGFR在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞周期進(jìn)程、分化和轉(zhuǎn)錄中起著重要的作用。EGFR的突變和過表達(dá)與許多癌癥的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān),已成為非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌、頭頸癌和結(jié)直腸癌等多類惡性腫瘤治療的熱門靶點(diǎn)之一。目前上市的針對EGFR靶點(diǎn)的藥物表現(xiàn)出臨床反應(yīng)率低和耐藥性的問題,EGFR分子表面的遺傳性和病理性突變以及EGFR與其它家族受體間異源二聚化是其中的二個(gè)主要原因,因此,靶向結(jié)構(gòu)上高度保守的EGFR二聚化界面有可能成為解決遺傳性和獲得性耐藥問題的有效策略,本實(shí)驗(yàn)室前期采用來自EGFR二聚化界面直接參與二聚化的β-環(huán)多肽EGFR~(237-267)做抗原,構(gòu)建了靶向EGFR二聚體界面的多肽疫苗和單克隆抗體,并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)初步證明了策略的可行性。納米抗體在大小、水溶性、穩(wěn)定性和制備方面具有很大的優(yōu)勢,將針對異源二聚化問題和納米抗體的特點(diǎn),本研究擬利用上述抗原肽從人源化納米抗體展示庫篩選靶向EGFR二聚化界面的納米抗體,以大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)建立高效制備方法,并進(jìn)行相應(yīng)的體外抑瘤活性研究,為進(jìn)一步研發(fā)靶向EGFR二聚體界面的治療性納米抗體打下基礎(chǔ)。方法:1.噬菌體展示技術(shù)篩選納米抗體通過本實(shí)驗(yàn)室專利針對EGFR~(237-267)二聚化界面的這段序列委托公司合成短肽。利用合成的抗原肽作為包被氨基化酶標(biāo)板的抗原,使用基于VH3-23重鏈片段,通過PCR突變CDR1,CDR2和CDR3區(qū)的堿基合成的具有多樣性的的人源化納米抗體庫,按照噬菌體展示篩選人源化抗體片段的方法,進(jìn)行三輪的噬菌體淘選,最后利用ELISA法得到靶向EGFR二聚化界面的特異性較高的納米抗體。通過基因測序最終得到抗體基因序列。2.納米抗體的原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建按大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計(jì)目的基因序列,在在目的基因序列的前后兩端分別加上NdeⅠ、HindⅢ的識(shí)別序列,并在3’端酶切位點(diǎn)前添加HIS-tag序列。將設(shè)計(jì)的目的基因序列委托公司合成,,克隆于大腸桿菌表達(dá)載體pET21b NdeⅠ-HindⅢ位點(diǎn),以便在T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下高效表達(dá)。目的基因表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌E.coli ShuffleT7-B中,以實(shí)現(xiàn)目的蛋白可溶性表達(dá)。3.納米抗體的表達(dá)和純化通過降低大腸桿菌培養(yǎng)過程中的溫度使納米抗體能夠可溶性表達(dá),利用弱陽離子柱CM Sepharose column(10 mm×150 mm)和Ni-NTA column(10 mm×150 mm)層析的方法純化目的產(chǎn)物。4.檢測納米抗體和過表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞表面特異性結(jié)合利用不同濃度的納米抗體和不同濃度的EGF作用于EGFR過表達(dá)的人表皮癌細(xì)胞A431,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面EGFR和納米抗體的特異性結(jié)合。5.利用MTT法檢測納米抗體對EGFR過表達(dá)腫瘤細(xì)胞的抑制率利用MTT法對比本實(shí)驗(yàn)室之前制備的單克隆抗體EGFR Dimer5G9根據(jù)相對應(yīng)的濃度檢測納米抗體對EGFR過表達(dá)腫瘤細(xì)胞A431(人表皮癌)和H292(人肺癌)的抑制率。結(jié)果:1.噬菌體展示技術(shù)篩選納米抗體最終篩選到11株陽性克隆菌株,通過測序得到4個(gè)不同的V區(qū)序列的納米抗體,其余的都與這4個(gè)V區(qū)序列完全一致。得到能夠表達(dá)靶向EGFR二聚化界面的納米抗體的4株不同的陽性克隆菌株,分別定名為EGFR dimer Nb77,EGFR dimer Nb80,EGFR dimer Nb96,EGFR dimer Nb104。2.納米抗體的表達(dá)與純化成功構(gòu)建含有EGFR dimer Nb77和EGFR dimer Nb96重組質(zhì)粒的E.coli ShuffleT7-B工程菌,并在30℃下實(shí)現(xiàn)可溶表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)陽離子交換和鎳柱親和層析二步純化,蛋白純度達(dá)到98%以上。3.檢測納米抗體和過表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞表面特異性結(jié)合其中檢測的納米抗體EGFR dimer Nb77對A431細(xì)胞具有特異性結(jié)合,而且隨著抗體濃度和EGF的濃度的增加,特異性結(jié)合越強(qiáng)。體現(xiàn)了A431腫瘤細(xì)胞對納米抗體EGFR dimer Nb77和EGF具有濃度依賴性。4.利用MTT法檢測納米抗體對EGFR過表達(dá)腫瘤細(xì)胞的抑制率EGFR dimer Nb77對于EGFR過表達(dá)的細(xì)胞株A431和H292都具有抑制活性,而且納米抗體EGFR dimer Nb77對于EGFR過表達(dá)的細(xì)胞株A431的抑制率隨著抗體濃度的增加而增大。和單克隆抗體EGFR Dimer 5G9對比具有相同的良好的抑瘤活性。靶向EGFR二聚化界面的納米抗體具有很好的治療腫瘤疾病的前景。結(jié)論:以來自EGFR二聚化界面直接參與二聚化的β-環(huán)多肽EGFR~(237-267)為抗原從商品來源人源化納米抗體庫篩選到了4株EGFR二聚體界面靶向的人源化納米抗體,并在宿主菌E.coli ShuffleT7-B中實(shí)現(xiàn)了其中EGFR dimer Nb77和EGFR dimer Nb96兩個(gè)納米抗體的高效可溶性表達(dá),高度純化的納米抗體EGFR dimer Nb77可特異性結(jié)合于細(xì)胞表面EGFR,并顯著抑制EGFR過表達(dá)腫瘤細(xì)胞的生長。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R945;R96
【圖文】：

藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第一章 引言由四種細(xì)胞表面受體組 ErbB4 / HER。其中表 HER1 / ErbB1）是人類的生長和分化中起重要作化的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，單個(gè)，配體結(jié)合區(qū)在胞外結(jié)構(gòu)

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文埋在結(jié)構(gòu)域Ⅳ中，使整個(gè)受體結(jié)構(gòu)構(gòu)象同源和異源二聚化。當(dāng)配體與 EGFR 的結(jié)構(gòu)象發(fā)生改變，二聚化臂暴露，使 EGF或異源二聚體[9-10]。導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酪氨酸通路激活有關(guān)細(xì)胞增殖、浸潤等相關(guān)基因肺癌，乳腺癌，胃癌，結(jié)腸直腸癌，頭R 成為抗癌藥物的理想靶點(diǎn)之一[15-19]。

91 0.070 0.161 2.392 0.074 0.256 3.594 0.073 0.176 2.495 0.072 0.167 2.396 0.069 0.272 3.9104 0.059 0.144 2.4111 0.068 0.227 3.3.4.3 陽性克隆測序結(jié)果將 11 株陽性克隆經(jīng)過測序后利用 DNAMAN 軟件比對分析后得到的結(jié)果為不同的基因序列。其氨基酸序列如圖 2-1，經(jīng)過和網(wǎng)上人源化納米抗體序列進(jìn)發(fā)現(xiàn)其基因序列具有相同的 FR 區(qū)基本結(jié)構(gòu)，故認(rèn)為篩選到了 4 株能夠表達(dá) EGFR 的人源化納米抗體的陽性克隆。其表達(dá)的納米抗體的理化性質(zhì)如表 2-

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