【摘要】：目的:研究鹽酸右美拖咪啶(dexmetomidine hydrochloride,DMED)發(fā)揮毒性作用的主要受體類型及受體后關(guān)鍵分子通路,明確鹽酸右美托咪啶毒性與鎮(zhèn)靜作用的不同機(jī)制。研究?jī)?nèi)容:1.α_(2B)-AR或α_1-AR拮抗劑對(duì)DMED鎮(zhèn)靜作用的影響:采用小鼠翻正反射模型,研究不同α_(2B)-AR或α_1-AR拮抗劑對(duì)DMED引起小鼠翻正反射消失的作用。2.α_2-AR或α_1-AR拮抗劑對(duì)DMED毒性作用的影響:提前給予不同的α_2-AR或α_1-AR拮抗劑,研究其能否降低DMED的致死率。3.DMED激活α_(2B)-AR受體后信號(hào)通路的研究:建立共表達(dá)α_(2B)-AR和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的活化T細(xì)胞核因子c1(EGFP-NFATc1)的U2OS細(xì)胞株,根據(jù)N FATc1核轉(zhuǎn)位評(píng)價(jià)不同化合物對(duì)α_(2B)-AR的激動(dòng)或抑制作用。建立共表達(dá)α_(2B)-AR受體和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的蛋白激酶A催化亞基(PKAcat-EGFP)的CHO細(xì)胞株,以PKA重分布實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)不同化合物激活或者拮抗α_(2B)-AR后對(duì)AC-cAMP-PKA信號(hào)通路的影響。4.DMED鎮(zhèn)靜及毒性作用的受體后機(jī)制的研究:評(píng)價(jià)Gαi/o抑制劑PTX、Gαq/11抑制劑YM-254890、PLC抑制劑U73122、胞內(nèi)Ca~(2+)螯合劑BAPTA和L-Ca~(2+)阻滯劑維拉帕米(verapamil)和尼莫地平(nimodipine)對(duì)DMED毒性效應(yīng)的作用;PT X及YM-254890對(duì)DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng)的作用;并觀察PTX及YM-254890對(duì)α_(2B)-AR信號(hào)通路的影響。研究方法:1.Prazosin、HEAT和imiloxan分別給藥后15 min,給予DMED,觀察小鼠翻正反射消失率、翻正反射消失的誘導(dǎo)時(shí)間和制動(dòng)時(shí)間,評(píng)價(jià)不同拮抗劑對(duì)DMED鎮(zhèn)靜作用的影響。2.α_2-AR或α_1-AR拮抗劑預(yù)先給藥15 min后,給予DMED,記錄大鼠、小鼠連續(xù)7天的死亡情況,以第1天死亡率和連續(xù)7天內(nèi)的死亡率為指標(biāo)評(píng)價(jià)各拮抗劑的抗致死作用。取小鼠肺組織進(jìn)行HE染色,觀察小鼠的肺組織損傷。3.將α_(2B)-AR的重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-Hygro-α_(2B)-AR)轉(zhuǎn)染至表達(dá)帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的活化T細(xì)胞核因子c1(NFATc1)的U2OS細(xì)胞(U2OS-EGFP-N FATc1-α_(2B)-AR),以及表達(dá)帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的蛋白激酶A催化亞基(PKA cat)的CHO細(xì)胞(CHO-PKAcat-EGFP-α_(2B)-AR),分別通過(guò)NFATc1核轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn)篩選U2OS-EGFP-NFATc1-α_(2B)-AR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,采用PKA重分布實(shí)驗(yàn)篩選CHO-PKAc at-EGFP-α_(2B)-AR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。以U2OS-EGFP-NFATc1-α_(2B)-AR細(xì)胞為工具細(xì)胞,評(píng)價(jià)α_2-AR激動(dòng)劑DMED對(duì)NFATc1核轉(zhuǎn)位的作用;α_2-AR拮抗劑鹽酸阿替美唑(ati pamezole,ATI)、α_(2A)-AR拮抗劑BRL44408,α_(1/2B)-AR拮抗劑鹽酸哌唑嗪(prazosin)、α_(2B)-AR選擇性拮抗劑ARC239和imiloxan,與DMED(10~(-7)M)共孵育,評(píng)價(jià)拮抗劑對(duì)DMED作用的對(duì)抗。以CHO-PKAcat-EGFP-α_(2B)-AR細(xì)胞為工具細(xì)胞,評(píng)價(jià)α_2-AR激動(dòng)劑DMED、可樂(lè)定、胍法辛對(duì)PKA重分布的作用;α_2-AR拮抗劑咪唑克生、ATI與DMED(10~(-7)M)共孵育后,評(píng)價(jià)拮抗劑對(duì)DMED作用的對(duì)抗。4.Gαq/11抑制劑YM-254890給藥后30 min,Gαi/o抑制劑PTX(0.25μg,i.c.v)給藥后4天,尾靜脈注射鎮(zhèn)靜或致死劑量的DMED,觀察對(duì)動(dòng)物鎮(zhèn)靜或死亡的影響。以U2OS-EGFP-NFATc1-α_(2B)-AR和CHO-PKAcat-EGFP-α_(2B)-AR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株為工具細(xì)胞,YM-254890或PTX與DMED共孵育后,評(píng)價(jià)YM-254890或PTX對(duì)D MED引起NFATc1核轉(zhuǎn)位以及PKA重分布的影響;U73122、BAPTA、維拉帕米或尼莫地平給藥后15 min,尾靜脈注射致死劑量的DMED,觀察對(duì)動(dòng)物死亡的影響。研究結(jié)果:1.α_1-AR或α_(2B)-AR拮抗劑對(duì)DMED鎮(zhèn)靜作用的影響:Prazosin、HEAT和imil oxan預(yù)先給藥后,對(duì)DMED引起的小鼠翻正反射消失沒(méi)有影響。2.α_2-AR或α_1-AR拮抗劑對(duì)DMED毒性作用的影響。2.1不同受體拮抗劑對(duì)DMED引起小鼠死亡的影響:ATI沒(méi)有抗致死作用;AR C239能夠顯著降低DMED(25.6 mg/kg)給藥后,小鼠在1天和連續(xù)7天的死亡率;Prazosin、HEAT、BRL44408和JP1302不同程度的降低DMED給藥后,小鼠在第1天內(nèi)的死亡率,對(duì)小鼠7天的死亡率沒(méi)有影響。2.2不同受體拮抗劑對(duì)DMED引起大鼠死亡的影響:Prazosin、HEAT和ARC239能夠不同程度的降低DMED(8 mg/kg,i.p)給藥后,大鼠在1天和連續(xù)7天的死亡率,ATI只能夠降低DMED(8 mg/kg,i.p)給藥后,大鼠在連續(xù)7天的死亡率;Prazosin顯著降低DMED(8 mg/kg,i.v)給藥后,大鼠在1天和連續(xù)7天的死亡率,ATI沒(méi)有抗致死作用;Prazosin能夠完全對(duì)抗DMED(8、16 mg/kg/mL,i.v,0.02mL/min)致死作用,ATI能夠完全對(duì)抗DMED(8、16 mg/kg/mL,i.v,0.02 mL/mi n)給藥后,大鼠在1天內(nèi)的死亡率,明顯降低連續(xù)7天內(nèi)大鼠的死亡率。2.3 DMED靜脈注射后對(duì)小鼠肺組織的損傷:小鼠緩慢尾靜脈注射DMED(25.6 mg/kg)后,小鼠肺部明顯淤血,肺組織HE染色發(fā)現(xiàn)明顯的肺部血管淤血,肺泡破裂并涌入大量的紅細(xì)胞。3.DMED激活α_(2B)-AR受體后信號(hào)通路的研究3.1α_(2B)-AR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立:成功構(gòu)建了α_(2B)-AR穩(wěn)定表達(dá)且功能較好的U2O S-EGFP-NFATc1-α_(2B)-AR細(xì)胞株以及CHO-PKAcat-EGFP-α_(2B)-AR細(xì)胞株。3.2 DMED激活α_(2B)-AR后對(duì)NFATc1信號(hào)通路的作用:DMED激活α_(2B)-AR后,可以濃度依賴的提高細(xì)胞NFATc1的相對(duì)核轉(zhuǎn)位水平,其EC_(50)值為(2.62±0.07)n M;ATI、ARC239、imiloxan、prazosin、BRL44408可以濃度依賴性對(duì)抗DMED(10~-77 M)的作用,IC_(50)值分別為(89.05±0.13)、(11.13±33.53)、(103.50±2.35)、(493.40±0.25)和(931±0.21)nM。α_2-AR拮抗劑的作用強(qiáng)度分別為:ARC239?ATI?imiloxan?prazosin?BRL44408。3.3 DMED激活α_(2B)-AR后對(duì)AC-PKA-PKA信號(hào)通路的作用:DMED、可樂(lè)定和胍法辛能夠激活α_(2B)-AR后,抑制AC-cAMP-PKA相關(guān)信號(hào)通路,逆轉(zhuǎn)由AC激活劑foskorlin所致的PKA彌散性分布,濃度依賴的提高PKA顆粒聚集程度,EC_(50)值分別為(1.15±0.11)nM、(11.0±0.44)nM和(58.5±0.08)nM。ATI和咪唑克生可以濃度依賴性對(duì)抗DMED(10~(-7)M)的作用,IC_(50)分別為(565.6±0.21)nM和(5.53±0.04)μM。4.DMED鎮(zhèn)靜及毒性作用的受體后機(jī)制的研究4.1 Gαq/11抑制劑YM-254890對(duì)DMED毒性及鎮(zhèn)靜作用的影響:YM-254890對(duì)DMED引起的動(dòng)物死亡無(wú)明顯作用,且不能對(duì)抗DMED的鎮(zhèn)靜作用。4.2 Gαi/o抑制劑PTX對(duì)DMED毒性及鎮(zhèn)靜作用的影響:PTX(0.25μg,i.c.v)預(yù)先給藥4天可以完全抑制DMED(0.17 mg/kg,i.v)誘導(dǎo)的小鼠翻正反射消失,但對(duì)DMED(25.6mg/kg,i.v)致死率的降低作用并不明顯,PTX能夠?qū)笵MED的鎮(zhèn)靜作用,不能對(duì)抗DMED的毒性作用。4.3 YM-254890對(duì)DMED激活α_(2B)-AR后信號(hào)通路的影響:Gq/11抑制劑YM-254890可以濃度依賴性降低DMED(10~(-7)M)導(dǎo)致的NFATc1核轉(zhuǎn)位,IC_(50)值為(103.50±2.34)nM。4.4 Gαi/o抑制劑PTX對(duì)DMED激活α_(2B)-AR后信號(hào)通路的影響:PTX對(duì)DMED促進(jìn)NFATc1核轉(zhuǎn)位的作用沒(méi)有影響。4.5 U73122、BAPTA、維拉帕米和尼莫地平對(duì)DMED毒性作用的影響:U73122無(wú)抗致死作用;BAPTA、維拉帕米和尼莫地平具有明顯抗致死作用。研究結(jié)論:1.α_1-AR或α_(2B)-AR不參與DMED的鎮(zhèn)靜作用。2.高劑量DMED的致死作用可能主要是由于DMED激動(dòng)α_(2B)-AR和α_1-AR引起的;DMED的致死作用可能與其引起的肺淤血有關(guān)。3.Gαi/o信號(hào)通路是DMED產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用激活的關(guān)鍵信號(hào)通路;DMED作用于α_(2B)-AR,引起胞內(nèi)Ca~(2+)濃度升高,導(dǎo)致大小鼠的死亡。創(chuàng)新點(diǎn):DMED致死作用受體主要是α_(2B)-AR和α_1-AR,而不是α_(2A)-AR和α_(2C)-AR,表明D MED的致死作用與鎮(zhèn)靜作用受體機(jī)制相分離,有利于指導(dǎo)毒性作用小的高選擇性鎮(zhèn)靜藥的篩選。
【學(xué)位授予單位】：煙臺(tái)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R965
【圖文】：

圖 1 Prazosin、imiloxan 和 HEAT 對(duì) DMED 誘導(dǎo)的鎮(zhèn)靜作用的影響。（A）誘導(dǎo)時(shí)間，（B 不間，Mean±S.E.M，n=10。Figure 1 Effect of prazosin, imiloxan, and HEAT on the sedation induced by DMED.(A) ion time, (B) immobilization time，Mean±S.E.M，n=10.

圖 2 Prazosin 、BRL44408 、ARC239 、imiloxan 、JP1302 和 HEAT 預(yù)先 15min 給藥對(duì) D 致死作用的影響。（A）DMED 給藥后第 1 日的致死作用，（B）DMED 給藥 7 日后的致死作用an±S.E.M, n=10，***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05，與 Control 組相比較。Figure 2 Effect of prazosin, BRL44408, ARC239，Imiloxan, JP1302 and HEAT on the letffect induced by DMED. (A) 1 day after DMED treatment；(B) 7 days after DMED treat

圖 4 ATI、ARC239、HEAT 和 prazosin 預(yù)先 15 min 給藥對(duì) DMED 致死作用的影響。（A）ED 給藥后第 1 日的死亡率，（B）DMED 給藥 7 日后的死亡率，Mean±S.E.M n=5，***P < 0.001，P < 0.01，*P < 0.05，與 Control 組相比較。Figure 4 Effect of ATI, ARC239，HEAT, Prazosin on the lethal effect induced by DMED.(A) 1 day after DMED treatment；(B) 7 days after DMED treatment, Mean±S.E.M, n=5，***P <

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本文編號(hào)：2756161