【摘要】：目的 胰島素是一類在人類胰腺中發(fā)現(xiàn)的分泌肽激素，它能提高葡萄糖的利用率。已有研究發(fā)現(xiàn)胰島素能誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞（小鼠成肌細(xì)胞，即肌前體細(xì)胞）增殖和肌細(xì)胞生成。胰島素如何誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞增殖的作用機(jī)制尚不明確。GATA-6是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。GATA-6在心肌細(xì)胞分化和保持血管平滑肌細(xì)胞分化表型中發(fā)揮重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）在脂類代謝如脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和β-氧化中起著重要調(diào)節(jié)作用。GATA-6和PPARα是否參與胰島素對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)將是一項(xiàng)很有趣的研究。細(xì)胞凋亡受BCL-2家族蛋白（B-細(xì)胞淋巴瘤-2）的調(diào)節(jié)，BAD（細(xì)胞凋亡BCL-2促凋亡蛋白）是BCL-2家族成員之一，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CyclinD1是D型細(xì)胞周期蛋白的一種。能與CDK4和CDK6作用激活細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期。但是有關(guān)cyclinD1和BAD在胰島素處理的C2C12細(xì)胞中的表達(dá)卻知之甚少。 方法 本研究中我們用MTT法、流式細(xì)胞分析、細(xì)胞凋亡定量、DAPI染色、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、Quantitative Real-Time PCR及Western Blot實(shí)驗(yàn)來研究胰島素對(duì)C2C12細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的作用。 結(jié)果 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10nM的胰島素處理C2C12細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞增殖（P＜0.01），而50nM和100nM的胰島素處理則誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞凋亡。與對(duì)照細(xì)胞相比，過表達(dá)GATA-6能促進(jìn)C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)（P＜0.01），這種促進(jìn)作用在給予10nM胰島素處理后得到增強(qiáng)而50nM和100nM胰島素處理后該促進(jìn)作用被逆轉(zhuǎn)。過表達(dá)GATA-6和PPARα雖然誘導(dǎo)細(xì)胞增殖但不能逆轉(zhuǎn)50nM和100nM胰島素誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡。 流式細(xì)胞分析表明10nM胰島素促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，50nM和100nM胰島素則將細(xì)胞周期阻滯在S期。過表達(dá)PPARα/GATA-6促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，在10nM胰島素處理時(shí)該促進(jìn)作用增強(qiáng)，而50nM和100nM胰島素處理時(shí)則逆轉(zhuǎn)該作用誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。且PPARα和GATA-6均不能緩解50nM和100nM胰島素產(chǎn)生的該阻滯作用。 DAPI染色結(jié)果顯示與對(duì)照細(xì)胞相比50nM和100nM胰島素處理的細(xì)胞表現(xiàn)出較高水平的染色質(zhì)固縮，而10nM胰島素處理的細(xì)胞染色均勻未表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡后染色質(zhì)固縮。PPARα和GATA-6均不能逆轉(zhuǎn)50nM和100nM胰島素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡染色質(zhì)固縮。 熒光素酶報(bào)告基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明不同濃度胰島素分別誘導(dǎo)cyclinD1和BAD的轉(zhuǎn)錄。10nM胰島素激活cyclinD1啟動(dòng)子活性，抑制BAD啟動(dòng)子的活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖。而50/100nM胰島素則激活BAD的啟動(dòng)子，抑制cyclinD1啟動(dòng)子活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。GATA-6和PPARα均能增強(qiáng)cyclinD1啟動(dòng)子活性，逆轉(zhuǎn)50nM胰島素誘導(dǎo)的cyclinD1啟動(dòng)子活性的降低，卻不能逆轉(zhuǎn)100nM胰島素產(chǎn)生的作用。而且，GATA-6和PPARα均能抑制50nM和100nM胰島素誘導(dǎo)的激活BAD啟動(dòng)子活性的作用。 Quatitive Real Time-PCR和Western Blot分析發(fā)現(xiàn)10nM和50/100nM胰島素處理細(xì)胞分別誘導(dǎo)cyclinD1和BAD的表達(dá)。10nM胰島素處理誘導(dǎo)cyclinD1的表達(dá)（P0.01），50/100nM胰島素處理則抑制cyclinD1的表達(dá)（P＜0.01），促進(jìn)BAD的表達(dá)。在過表達(dá)GATA-6或PPARα的C2C12細(xì)胞中也得到了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雖然過表達(dá)GATA-6的細(xì)胞中cyclinD1的表達(dá)顯著升高（P＜0.01），但是卻不能逆轉(zhuǎn)50nM和100nM胰島素誘導(dǎo)產(chǎn)生的cyclinD1表達(dá)降低和BAD表達(dá)升高。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胰島素通過調(diào)節(jié)cyclinD1和BAD的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡。進(jìn)一步闡述了胰島素促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖和凋亡這一作用機(jī)制。 結(jié)論 以上數(shù)據(jù)表明胰島素以劑量依賴的方式雙向誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞增殖和凋亡，cyclinD1和BAD參與胰島素調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R96
【圖文】：

第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 不同濃度胰島素對(duì)細(xì)胞增殖的影響為了闡明胰島素在細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用我們將C2C12細(xì)胞接種到96孔板中，隨后分別用 10nM、50nM、100nM 胰島素處理 24 小時(shí)。用 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力。如圖 4.1 所示，與對(duì)照細(xì)胞相比 10nM 胰島素處理的 C2C12 細(xì)胞活力增加了 76%。而 50nM 胰島素處理的 C2C12 細(xì)胞活力降低了 21%，100nM 胰島素處理的 C2C12 細(xì)胞活力降低了 32%。數(shù)據(jù)分析表明 10nM 胰島素處理和未用處理的對(duì)照細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的不同（P＜0.01）（圖 4.1）。以上數(shù)據(jù)表明胰島素以劑量依賴性的方式促進(jìn) C2C12 細(xì)胞增殖和拮抗增殖的作用。10nM 胰島素促進(jìn)細(xì)胞增殖，而 50nM 和 100nM 胰島素則抑制細(xì)胞增殖。

4.2 不同濃度胰島素對(duì)細(xì)胞周期的影響為了證明 50nM 和 100nM 胰島素拮抗 C2C12 細(xì)胞增殖的作用是否是由于其阻滯了細(xì)胞周期而引起的，我們進(jìn)行了流式細(xì)胞分析。我們分別將 10nM、50nM、100nM 胰島素處理 24 小時(shí)后的 C2C12 細(xì)胞在 PI 染色后進(jìn)行 FACS 分析。與對(duì)照細(xì)胞相比 10nM 胰島素處理的 C2C12 細(xì)胞 G0/G1期所占百分比降低了 24% 而 G2/M 期比值增加了 37% （圖 4.2）。MTT 實(shí)驗(yàn)表明 10nM 胰島素促進(jìn)細(xì)胞增殖，與 10nM 胰島素處理的細(xì)胞相比 50nM 胰島素處理的 C2C12 細(xì)胞表現(xiàn)出 S 期增加 66% ，G2/M 期的比值降低了 7%。100nM 胰島素處理的細(xì)胞 S 期增加了 71% ，G2/M 期的比值降低了 12%（圖 4.3）。以上結(jié)果表明 50nM和 100nM 胰島素處理誘導(dǎo) C2C12 細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯在 S 期。

4.3 不同濃度胰島素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞流式分析表明 50nM 和 100nM 胰島素由于阻滯細(xì)胞周期而引起拮抗細(xì)胞增殖的作用。為了研究 50nM 和 100nM 胰島素拮抗細(xì)胞增殖的作用是否由于其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡引起的，我們分別檢測(cè) 10nM、50nM 和 100nM 胰島素處理 24小時(shí)的 C2C12 細(xì)胞凋亡染色質(zhì)固縮的情況。用 DAPI 對(duì)細(xì)胞核 DNA 進(jìn)行染色質(zhì)著色。染色的細(xì)胞核呈藍(lán)色，20X 物鏡下成像觀察，并拍攝圖像。與對(duì)照細(xì)胞相比 50nM 和 100nM 胰島素處理的細(xì)胞表現(xiàn)出較高水平的染色質(zhì)固縮，并有顆粒物質(zhì)形成。而 10nM 胰島素處理的細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞細(xì)胞核完整且染色均勻，未表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡后的染色質(zhì)固縮（圖 4.3）。該結(jié)果表明胰島素以劑量依賴的方式雙向誘導(dǎo) C2C12 細(xì)胞凋亡。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張乾勇;PPAR的結(jié)構(gòu)與功能及其生物學(xué)作用[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè));2000年05期

2 魯曉杰;陳開來;羅其中;;過氧化物酶體增殖因子活化受體γ和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[J];國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志;2006年01期

本文編號(hào)：2755979