【摘要】：輔酶原位再生系統(tǒng)是指在依賴輔酶的反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)部,用催化氧化/還原的方法實現(xiàn)輔酶在氧化態(tài)與還原態(tài)之間的循環(huán)。這種催化輔酶再生的方法可以大幅減少工業(yè)生產(chǎn)中輔酶的投入量,減少生產(chǎn)成本。本研究利用偶聯(lián)醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶構(gòu)建NADH再生系統(tǒng),將該系統(tǒng)應(yīng)用于藥物中間體(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯[(S)-CHBE]的合成。利用偶聯(lián)阿拉伯糖醇脫氫酶和NADH氧化酶構(gòu)建NAD~+再生系統(tǒng),并應(yīng)用于稀有糖L-木酮糖的合成,具體研究內(nèi)容如下:(1)表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化:從菌株Bartonella apis,Bacillus sp.ZJ和Aspergillus nidulans中抽提基因組DNA,通過PCR技術(shù)克隆出目的基因,根據(jù)來源物種名稱,將醇脫氫酶,葡萄糖脫氫酶和阿拉伯糖醇脫氫酶分別命名為BaADH,BsGDH和ArDH。將目的基因連接到表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)上,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主E.coli BL21中。(2)酶的表達(dá)和性質(zhì)表征:BaADH和ArDH的最適溫度分別為50℃和40℃,分別在pH為8.0和9.5的緩沖液中表現(xiàn)出最大活性;添加Mn~(2+)能明顯提高酶的活性。在30℃時,BaADH在保溫35 h后失去一半活性,而ArDH的活性半衰期為8.3 h。米氏常數(shù)測定的結(jié)果顯示,對于BaADH,V_(max)=190.4 U/mg,K_m=0.11mM;對于ArDH,V_(max)=9.1 U/mg,K_m=1.2 mM。(3)利用BaADH-BsGDH構(gòu)建NADH輔酶再生體系,分別對反應(yīng)溫度、pH、輔酶濃度和底物濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,使用pH 7.0 Tris-HCl緩沖液,該催化系統(tǒng)在35℃反應(yīng)8 h后,100 mM的COBE的轉(zhuǎn)化率達(dá)到94.9%,NADH濃度為0.5μM時,輔酶總轉(zhuǎn)化數(shù)(TTN)達(dá)到5940,可滿足工業(yè)應(yīng)用的要求。(4)利用ArDH-Nox構(gòu)建NAD~+輔酶再生體系,對系統(tǒng)的催化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明在pH 5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中30℃催化氧化20 mM阿拉伯糖醇,反應(yīng)8 h的轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.5%,NADH濃度為5μM時,最高TTN值為1020。本文建立了輔酶NAD(H)的酶偶聯(lián)再生系統(tǒng),利用該輔酶再生體系實現(xiàn)了藥物中間體和稀有糖的酶促生產(chǎn),體現(xiàn)輔酶再生系統(tǒng)在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R914
【圖文】：

圖 1.1 偶聯(lián)酶再生輔酶示意圖.1 Cofactor regeneration by enzyme coupling 輔酶時，由于其只需要輔底物而不需要偶聯(lián)置，節(jié)省了偶聯(lián)酶表達(dá)和純化所需的生產(chǎn)成條件反應(yīng)不一樣時，有必要優(yōu)化條件并找到H。底物偶聯(lián)法單酶催化的特點(diǎn)避免了主反制性影響，但底物偶聯(lián)法的局限性也是很明要該酶既能利用一種底物進(jìn)行氧化還原的主再生的副反應(yīng)（圖 1.2）。

圖 1.2 通過共底物再生輔酶示意圖 1.2 Cofactor regeneration by substrate coupling me關(guān)的酶進(jìn)行再生的過程中，通常是引入例如甲酸脫氫酶氧化還原酶消耗 NADH 進(jìn)行主反應(yīng)的同時，偶聯(lián)第二底物進(jìn)行氧化反應(yīng)[21]。而關(guān)于氧化型輔酶 N氧化酶催化氧化 NADH 進(jìn)行氧化型煙酰胺的再生置，操作簡單，適用范圍廣，以及廉價的額外底用的一種方法。另外，由于一些主反應(yīng)的酶專一物來啟動酶的另一個反應(yīng)，利用單個酶即可達(dá)到

種輔酶再生體系生產(chǎn)（A）(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯和（B糖Fig 1.3 Two coenzyme regeneration systems which produce (A(S)-4-chloro-3-hydroxybutyrate and (B) L-xylulose的主要研究內(nèi)容原酶的克隆表達(dá)基因挖掘，篩選含有醇脫氫酶，葡萄糖脫酶基因的菌株，抽提菌株的基因組 DNA，用設(shè)計的引物擴(kuò)增，并連接到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒上，構(gòu)建重組表達(dá)宿主。 BaADH 和葡萄糖脫氫酶 BsGDH 的性質(zhì)表征，偶聯(lián)構(gòu)建

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李林波;羅宇;屈凌波;熊玉春;李鳳娟;;NADH氧化酶研究進(jìn)展[J];河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2010年04期

2 董志姚;李秀芬;劉立明;堵國成;陳堅;;過量表達(dá)NADH氧化酶加速光滑球擬酵母合成丙酮酸[J];微生物學(xué)報;2008年08期

本文編號：2755932