【摘要】：在癌癥病人中,腫瘤耐藥和轉移是導致治療失敗的重要原因。GST同工酶的異常表達與細胞耐藥密切相關。雙依他尼酸乙二胺(EDEA)為自主合成的芳香酰胺類GST抑制劑,其同工酶選擇性為GSTMGSTAGSTP。前期研究發(fā)現其對耐順鉑卵巢腫瘤細胞株SKOV3/DDP及其荷瘤鼠有增敏作用,對肺癌耐藥細胞株A549/DDP有增敏但對應荷瘤鼠無顯著作用,而對胃癌耐藥細胞株SGC7901/DPP無明顯增敏效果。提示不同耐順鉑腫瘤細胞株可能存在不同耐藥相關GST同工酶;對不同腫瘤設計相應GST同工酶選擇性抑制劑必將面臨技術和成本挑戰(zhàn),而識別與多種腫瘤細胞株耐藥及遷移相關的GST同工酶為靶設計其抑制劑更具有現實意義。選擇耐順鉑實體瘤細胞株肺癌A549/DDP、卵巢癌SKOV3/DDP、胃癌SGC7901/DPP。用western-blot檢測上述幾種耐藥與非耐藥腫瘤細胞裂解液GST同工酶蛋白表達,并通過EDEA作用檢測裂解液中對抑制劑敏感的GST同工酶。再通過si RNA選擇性沉默GST同工酶,CCK8檢測耐藥腫瘤細胞株DDP IC50比較增敏作用,同時通過流式細胞計數及Hoechst33343檢測細胞凋亡情況。CCK8檢測GST同工酶基因沉默及EDEA抑制作用下4HNE毒性作用,以探索可能作用機理。通過劃痕實驗及Transwell檢測si RNA選擇性沉默GST同工酶后對細胞遷移的影響,Western-blot檢測EDEA對遷移相關信號通路蛋白表達影響。與非耐藥細胞相比,上述耐順鉑腫瘤細胞株GST總活增加。Western-blot顯示,A549/DDP中GSTP1、GSTA1蛋白表達降低,GSTM2表達增加;SGC7901/DDP中GSTP1、GSTM2及GSTA1蛋白表達降低;SKOV3/DDP中GSTP1、GSTM2及GSTA1蛋白表達增加。對EDEA作用最敏感的GSTM活性在SKOV3/DDP中顯著增加,在SGC7901/DDP中有一定增加;對EDEA作用較敏感的GSTA在A549/DDP中顯著增加。在不同細胞株,沉默GST同工酶顯示不同的增敏作用。在A549/DDP中,沉默GSTM2、GSTA1分別增敏2倍、5倍,沉默GSTP1無顯著影響;在SKOV3/DDP中,沉默GSTM2、GSTA均增敏2倍,沉默GSTP1無顯著影響;在SGC7901/DDP中,沉默GSTP1、GSTM2、GSTA1分別增敏4倍、1.3倍、6倍。可見在三種細胞中,與GSTP1、GSTM2相比,GSTA1對耐藥的作用最顯著。流式細胞計數及Hoechst33343檢測細胞凋亡發(fā)現相似結果。在A549/DDP中,沉默GST同工酶或EDEA抑制,4HNE IC_(50)顯著降低。由于GSTM選擇性抑制劑EDEA作用至使A549/DDP遷移增加,進一步考察沉默GST同工酶對A549/DDP遷移的影響。劃痕實驗及Transwell實驗均顯示,沉默GSTM2后A549/DDP細胞遷移能力與對照組比較顯著增加,而GSTP1沉默及GSTA1沉默對其遷移能力無明顯影響。Western blot實驗顯示EDEA增加細胞遷移的機制可能與激活EGFR進而激活AKT/PI3K通路有關。綜上所述,GST表達及酶活增加與細胞耐藥相關。通過EDEA抑制及GST同工酶基因沉默初步證明不同細胞株與耐藥相關的GST同工酶不同;相對于GSTM2、GSTP1,沉默GSTA1對A549/DDP、SKOV3/DDP、SGC7901/DDP均有最顯著的增敏作用,其增敏可能與4HNE有關,提示GSTA1可能是多種腫瘤耐藥細胞逆轉耐藥的靶點;抑制或沉默GSTM2后,A549/DDP細胞遷移能力增加,機制可能與激活AKT/PI3K通路有關。提示GSTM不宜作為研究增敏的靶點。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R96
【圖文】：

圖 1 不同細胞株裂解液 GST 對 EDEA 抑制響應曲線Fig1 Inhibition response of GST in different tumor cell lines against EDEA2.3 各細胞株中 GSTP1、GSTM2、GSTA1 蛋白表達Western blot 檢測了 A549 與 A549/DDP、SGC7901 與/DDP、SKOV3 與SKOV3/DDP 細胞內 GSTP1、GSTM2、GSTA1 蛋白表達情況(圖 2)，發(fā)現與敏感細胞株相比，耐順鉑細胞株 A549/DDP 中 GSTP1 及 GSTA1 蛋白表達增加，GSTM2蛋白表達降低；耐順鉑細胞株 SGC7901/DDP 中 GSTP1、GSTM2 及 GSTA1 蛋白表達降低；耐順鉑細胞株 SKOV3/DDP 中 GSTP1、GSTM2 及 GSTA1 蛋白表達增加。*p<0.05。bca

圖 1 不同細胞株裂解液 GST 對 EDEA 抑制響應曲線Fig1 Inhibition response of GST in different tumor cell lines against EDEA2.3 各細胞株中 GSTP1、GSTM2、GSTA1 蛋白表達Western blot 檢測了 A549 與 A549/DDP、SGC7901 與/DDP、SKOV3 與SKOV3/DDP 細胞內 GSTP1、GSTM2、GSTA1 蛋白表達情況(圖 2)，發(fā)現與敏感細胞株相比，耐順鉑細胞株 A549/DDP 中 GSTP1 及 GSTA1 蛋白表達增加，GSTM2蛋白表達降低；耐順鉑細胞株 SGC7901/DDP 中 GSTP1、GSTM2 及 GSTA1 蛋白表達降低；耐順鉑細胞株 SKOV3/DDP 中 GSTP1、GSTM2 及 GSTA1 蛋白表達增加。*p<0.05。a

OD 值))/(對照孔 OD 值-調零孔 OD 值)。使用 SPSS 19.0 計算細胞 IC50。2 實驗結果2.1 siRNA 沉默 GST 同工酶的有效序列篩選Western blot 結果檢測了 A549/DDP，SKOV3/DDP，SGC7901/DDP 細胞轉染不同 siRNA 后，GST 表達情況。選取相應的 GST siRNA 進行下一步實驗。在A549/DDP，si-GSTP1 選擇 siRNA1，si-GSTM2 選擇 siRNA2，si-GSTA1 選擇 siRNA1；在 SKOV3/DDP，si-GSTP1 選擇 siRNA3，si-GSTM2 選擇 siRNA2，si-GSTA1 選擇siRNA2；在 SGC7901/DDP，si-GSTP1 選擇 siRNA3，si-GSTM2 選擇 siRNA1，si-GSTA1 選擇 siRNA2(圖 3)。

【參考文獻】

相關碩士學位論文 前2條

1 劉芳;GSTM潛抑制劑對耐順鉑腫瘤細胞體內外增敏作用[D];重慶醫(yī)科大學;2016年

2 許榜田;谷胱甘肽-S-轉硫酶Mu二價潛抑制劑設計、合成及表征[D];重慶醫(yī)科大學;2014年

本文編號：2755799