【摘要】：組蛋白去乙�；�(Histone deacetylase,HDACs)可催化水解底物ε-N-乙�；嚢彼釟埢摮阴；�,其底物包括組蛋白或非組蛋白的底物。該酶在表觀遺傳調控和多種細胞的調節(jié)過程中起關鍵作用,特別是該酶在許多腫瘤組織中高表達,HDACs成為癌癥治療領域的熱門靶標。組蛋白去乙�；敢种苿�(histone deacetylase inhibitors,HDACi)可引起腫瘤細胞凋亡、細胞周期阻滯和DNA損傷等作用,目前已有多個藥物上市。當前在HDAC抑制劑的研發(fā)中,急需發(fā)展新型的高通量HDACs抑制劑篩選方法,以加快藥物發(fā)現(xiàn)的速度。隨著近十幾年的發(fā)展,毛細管電泳(capillary electrophoresis,CE)已成功應用于多種藥物靶標的活性篩選。該方法的主要優(yōu)點包括測試模式多且效率高、分析時間短、酶和底物消耗量低以及能夠實現(xiàn)自動化運行。除了傳統(tǒng)的離線分析手段,該領域還發(fā)展了毛細管在線分析技術,包括電泳調控微分析法和固定化酶微反應器法。這兩種常見的毛細管在線分析手段已被廣泛應用于酶學研究。電泳調控微分析法(Electrophoretical mediated microanalysis,EMMA)是在毛細管內,同時進行酶促反應以及其底物和產物分離測試的在線分析方法。該方法將酶和底物依次進樣至毛細管前端,并以此作為酶促反應發(fā)生場所。通過施加電壓,促使酶和底物在管內充分混合反應;反應結束后,施加分離電壓使產物和未反應底物在毛細管內分離并進行測定。毛細管電泳固定化酶微反應器(Capillary electrophoresis immobilized enzyme microreactor,CE-IMERs)是將毛細管電泳與固定化酶技術相結合的新型在線酶學測定方法。該方法通過一定的固定化方式將靶酶固定在毛細管的進樣端,于是制備得到CE-IMERs,用于酶促反應動力學和酶抑制劑動力學在線研究。該法的優(yōu)點在于試劑消耗量小、操作簡便、可實現(xiàn)靶酶的重復使用,是新型的酶抑制劑高通量篩選方法。我們應用電泳調控微分析法,實現(xiàn)了 HDACs抑制劑的毛細管電泳在線篩選,為該類抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了新的篩選模型。本文對分離條件、混合條件等方面進行了優(yōu)化,并對初步建立的方法進行了方法學驗證,證明該方法穩(wěn)定、高效、可重復。我們應用所建方法測定了 HDACs的動力學參數和3種經典HDACs抑制劑的表觀抑制常數。本文建立的EMMA方法測定結果與經典熒光法及文獻報道結果基本一致,說明該法結果準確、可靠。本文使用海藻酸鈣包埋法制作了 HDACs毛細管電泳固定化酶微反應器,通過將含有HDACs的海藻酸鈉溶膠灌注于毛細管一端,施加電壓驅動緩沖液中鈣離子通過溶膠區(qū)域與鈉離子置換,在毛細管端口形成海藻酸鈣凝膠,從而將HDACs包埋并固定在毛細管端口。經條件優(yōu)化,初步建立的毛細管電泳固定化酶微反應器穩(wěn)定性和批間重復性良好,所測定的HDACs酶促反應動力學結果和HDACs抑制劑動力學結果與文獻報道基本一致。以上結果說明,本法制得的CE-IMERs具有測試簡單高效、節(jié)約反應物料以及自動化程度高等優(yōu)點,未來可能成為組蛋白去乙�；敢种苿┭邪l(fā)的有力武器。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R91
【圖文】：

山東大學碩士學位論文逡逑目前腫瘤藥物研究的熱點話題之一，目前經典的ＨＤＡＣｓ抑制劑的結構分為逡逑部分：表面識別區(qū)、鉸鏈區(qū)和鋅離子螯合基團（見圖Ｍ）邋＾抑制劑的類型逡逑鋅離子螯合基團的不同分為可以為異羥肟酸類（如Ｍｅｒｃｋ公司研制的逡逑ｏｓｔａｔ和Ｔｓｕｊｉ發(fā)現(xiàn)的天然產物ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ）、鄰苯二胺類（如Ｍｉｔｓｕｉ逡逑ｉｃａｌｓ公司開發(fā)的Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ和國產原研抗癌藥物西達本胺）和環(huán)肽類（如逡逑ｃｅｓｔｅｒ邋研發(fā)的邋Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ）。［２４，２５］逡逑

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋ＨＤ邋ＡＣ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｍａｒｋｅｔ逡逑１．２．２組蛋白去乙�；敢种苿┑淖饔脵C制逡逑現(xiàn)階段研宄表明，組蛋白去乙�；钢饕饔糜诎┊惓Ｒ阴；慕M蛋白上其去乙�；瑥亩绊懴掠伪姸嘈盘柾�，實現(xiàn)其抗腫瘤活性。其具體作用主要為以下幾個方面：逡逑表１－３組蛋白去乙�；傅淖饔脵C制逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－３邋Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ＨＤＡＣｉ逡逑功能表現(xiàn)邐作用機制逡逑阻滯腫瘤細胞的邐抑制細胞周期蛋ｄ和周期蛋ａ依賴性激酶的細胞周期邐腫瘤細胞停滯在Ｇ１或Ｇ２／Ｍ期逡逑誘導腫瘤細胞凋亡邐胞外細胞凋亡通路：上調死亡受體及于其相關蛋

者的相互作用使含有放射性的乙�；c閃爍劑靠近，激發(fā)ＳＰＡ珠閃爍，從而被逡逑閃爍計數器檢測。而經ＨＤＡＣｓ催化的脫乙�；牡孜镏校郏常龋菝撀�，從而使ＳＰＡ逡逑信號減少。通過測定ＳＰＡ信號的多少來反應ＨＤＡＣｓ的活性。方法原理如圖１－３逡逑所示。此方法可在微孔板中直接測定ＳＰＡ的強度，無需提取分離步驟。逡逑１０逡逑

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10 陳W

本文編號：2754060