【摘要】：目的:腫瘤嚴(yán)重威脅人類生命健康,且發(fā)生率呈逐年上升趨勢。目前,大多數(shù)化療藥物屬于細(xì)胞毒類藥物,毒副作用大。因此,尋找安全有效的抗腫瘤藥物已成為科學(xué)家和臨床醫(yī)學(xué)工作者面臨的重大挑戰(zhàn)。恩再適(analgecine,AGC),系牛痘疫苗致炎兔的皮膚提取物,是在健康家兔皮膚內(nèi)接種人用牛痘疫苗產(chǎn)生的小分子非蛋白活性物質(zhì)。恩再適對神經(jīng)損傷或由其他疾病引起的慢性疼痛、冷感、麻木等癥狀均有顯著療效,除此之外,恩再適還具有抑制或減輕炎癥反應(yīng)、雙向調(diào)節(jié)機體免疫的作用,然而腫瘤的發(fā)展過程與炎癥反應(yīng)及免疫功能低下都息息相關(guān)。因此,探討恩再適是否具有抗腫瘤作用,無疑具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。方法:(1)體外抑瘤活性檢測:復(fù)蘇培養(yǎng)Hep G2、LM3、He La、A549和H460五種人源腫瘤細(xì)胞,以不同濃度恩再適分別作用上述細(xì)胞24 h,使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性。(2)淋巴細(xì)胞因子分泌刺激實驗:無菌分離小鼠脾臟,制備并培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞,不同濃度恩再適作用于細(xì)胞24 h,收集上清,采用ELISA試劑盒檢測恩再適對其分泌細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-12的影響。(3)淋巴細(xì)胞刺激上清對腫瘤細(xì)胞的影響:采用恩再適刺激脾淋巴細(xì)胞,將其上清液以不同體積比分別與Hep G2細(xì)胞共培養(yǎng)24 h,使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性。(4)體內(nèi)抑瘤活性:將皮下接種LM3成瘤的BALB/C裸鼠隨機分成5組,分別是空白對照組,陽性對照組,恩再適低、中、高劑量組。空白對照組給予0.9%氯化鈉注射液,0.2 ml/d;陽性對照組給予環(huán)磷酰胺,20 mg/kg,隔天給藥一次;恩再適低、中、高劑量組,分別給予0.01 U/g/d、0.02 U/g/d和0.04 U/g/d。給藥方式均為腹腔注射,連續(xù)給藥15天,動態(tài)監(jiān)測腫瘤體積及體重。結(jié)束實驗時取出腫瘤組織和脾臟組織并進行稱重和測量,計算抑瘤率和脾臟指數(shù)。(5)聯(lián)合給藥體內(nèi)抑瘤實驗:將皮下接種LM3成瘤的BALB/C裸鼠隨機分成5組,分別是對照組,恩再適組,環(huán)磷酰胺低、高劑量組,恩再適與環(huán)磷酰胺聯(lián)合給藥組。對照組給予0.9%氯化鈉注射液,0.2 ml/d;恩再適組,0.02 U/g/d;環(huán)磷酰胺低、高劑量組,分別給予10 mg/kg和20 mg/kg,隔兩天給一次藥;恩再適與環(huán)磷酰胺聯(lián)合給藥組,0.02 U/g+10 mg/kg,恩再適每天給一次藥,環(huán)磷酰胺隔兩天給一次藥。給藥方式均為腹腔注射,連續(xù)給藥15天。結(jié)束實驗時將腫瘤組織和脾臟組織取出并進行稱重和測量,計算抑瘤率和脾臟指數(shù)。結(jié)果:(1)恩再適對培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞具有一定的增殖抑制活性:隨恩再適濃度的增加,5種腫瘤細(xì)胞的抑制率逐漸增加,當(dāng)恩再適濃度達到1.63 U/ml時,對Hep G2、LM3、H460、A549、He La細(xì)胞的抑制率分別為58.95%、55.08%、57.28%、45.80%、48.18%。(2)恩再適具有刺激淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的作用:采用不同濃度恩再適作用脾淋巴細(xì)胞后,IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-12的分泌水平均有所提高。與對照組相比,恩再適0.163和0.815 U/ml組脾淋巴細(xì)胞IL-2、IFN-γ和IL-4的分泌水平顯著提高(P0.01)。恩再適0.0815、0.163和0.815 U/ml組IL-12的分泌水平均顯著提高(P0.01)。(3)恩再適刺激的脾淋巴細(xì)胞上清液使Hep G2細(xì)胞增殖受到抑制,當(dāng)上清液體積達到100%,與相同濃度恩再適單獨處理組相比,Hep G2細(xì)胞的增殖顯著抑制(P0.01)。(4)恩再適體內(nèi)抑瘤活性:恩再適低、中、高劑量組的裸鼠體重變化曲線與空白對照組基本一致,各組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。實驗結(jié)束時,恩再適低、中、高劑量組的抑瘤率分別為25.24%、34.71%、49.86%,脾臟指數(shù)分別為1.15、1.23、1.17,與空白對照組相比,各處理組均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05或P0.01)。(5)恩再適聯(lián)合給藥抑瘤效應(yīng):環(huán)磷酰胺低、高劑量組降低裸鼠體重,而恩再適組、聯(lián)合給藥組的裸鼠體重變化曲線與對照組基本一致,沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。實驗結(jié)束時,恩再適組,環(huán)磷酰胺低、高劑量組,聯(lián)合給藥組的抑瘤率分別為22.25%,33.21%,62.67%,60.95%,與對照組相比,各處理組均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01);與恩再適組或環(huán)磷酰胺低劑量組相比,聯(lián)合給藥組存在顯著性差異(P0.01);與環(huán)磷酰胺高劑量組相比,聯(lián)合給藥組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與聯(lián)合給藥組的脾臟指數(shù)相比,恩再適組和環(huán)磷酰胺低、高劑量組均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),與對照組沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:恩再適一方面對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制的作用,另一方面,能夠通過上調(diào)體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-12的分泌水平,增強細(xì)胞免疫功能,進一步增強其抗腫瘤的作用。恩再適對機體無毒副作用,安全性高,能夠提高機體免疫功能,抑制裸鼠LM3皮下移植瘤的生長。恩再適還可以作為抗癌輔助藥與化療藥物環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用,不僅能夠降低環(huán)磷酰胺用量以減輕其對機體的損害,還能夠起到抗瘤增效作用,預(yù)示恩再適在癌癥治療方面的應(yīng)用前景十分廣闊。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96
【圖文】：

圖 1 恩再適對小鼠脾淋巴細(xì)胞上清中 IL-2（A）、IFN-γ （B）、IL-4（C）和 IL-12（D）的影響注：*P＜0.05，**P＜0.01，與陰性對照組比較； x±s，n=3Fig.1 The effect of analgecine on the IL- 2（A），IFN- γ （B），IL- 4（C） and IL-12（D） produced by the cultured mice splenic lymphocytes.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with control group； x±s，n=33.3 恩再適刺激淋巴細(xì)胞上清液對 HepG2 細(xì)胞增殖的影響淋巴細(xì)胞上清液中含有多種免疫活性因子，綜合上述 ELISA 檢測結(jié)果，采用恩再適 0.163 U/ml 刺激脾淋巴細(xì)胞上清液作用于 HepG2 細(xì)胞。結(jié)果如圖 2 所示，

圖 3 恩再適對 LM3 移植瘤裸鼠體重的影響（ x±s，n=6）Fig.3 Effect of analgecine on body weight of LM3 nude mice（ x±s，n=6）2 恩再適對人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用將人肝癌細(xì)胞 LM3 接種于 BALB/C 裸鼠皮下，接種后當(dāng)腫瘤體積長至 100-30時，按照腫瘤體積隨機分組給藥，分為空白對照組，陽性對照組，恩再適低高劑量組共五組。使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑（a）、短徑（b），計算腫瘤體，繪制腫瘤生長曲線。從各組的腫瘤體積增長情況來看，陽性對照組和恩再適中高劑量組在給藥第六天，與空白對照組相比較，已存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05圖 4），且抑瘤作用與計量有一定相關(guān)性。第十六天結(jié)束實驗時，空白對照組鼠的腫瘤重量為 1.01±0.24 g，陽性對照組的瘤重為 0.21±0.10 g，恩再適劑量組（0.01 U/g）、中劑量組（0.02 U/g）、高劑量組（0.04 U/g）的瘤重

圖 4 恩再適對 LM3 移植瘤裸鼠瘤體積的影響（ x±s，n=6）4 Effect of analgecine on tumor volume in LM3 transplanted nude mice（ x±

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 宋軍;張麗萍;孫鴻;宋丹丹;;牛痘疫苗致炎兔皮提取物治療帶狀皰疹相關(guān)性疼痛的效果及對血清IL-2、TNF-α的影響[J];中國當(dāng)代醫(yī)藥;2015年30期

2 黃伸;徐有浪;;牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液治療帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛的可行性及對腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子水平的影響[J];臨床合理用藥雜志;2015年27期

3 張俊;Yong-Seong Shin;胡安君;杜芳芳;李永亮;王學(xué)兵;張紅英;;環(huán)磷酰胺致大鼠免疫抑制和免疫亢進模型的建立與評價[J];中國實驗動物學(xué)報;2015年04期

4 黃若俊;任華益;;老藥新用抗腫瘤作用的研究進展[J];腫瘤藥學(xué);2013年06期

5 李瑞娜;;恩再適聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療面神經(jīng)炎的療效觀察[J];實用藥物與臨床;2013年03期

6 高瑋;劉曉宇;曾秋婷;段滿林;徐建國;;牛痘疫苗致炎兔皮提取物在上腹部手術(shù)術(shù)后鎮(zhèn)痛的效果[J];臨床麻醉學(xué)雜志;2012年11期

7 張國轉(zhuǎn);梁立雙;于少華;劉旭東;;牛痘疫苗致炎兔皮提取物治療帶狀皰疹后神經(jīng)痛的療效評價[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2010年09期

8 付曉瑞;董旭輝;孫振昌;張明智;;硫辛酸聯(lián)合恩再適治療化療藥物致周圍神經(jīng)病變的療效觀察[J];中國全科醫(yī)學(xué);2010年11期

9 潘云峰;郭興華;肖楚吟;吳玉瓊;;牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)疼痛的療效觀察[J];中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志;2009年09期

10 李紹發(fā);巫穎;;恩再適聯(lián)合前列腺素E_1治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的效果觀察[J];右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年04期

本文編號：2753758