【摘要】：目的:縫合常應(yīng)用于臨床手術(shù)中創(chuàng)口的封閉,但其不僅難以應(yīng)用于脆性器官、難以防止組織體液外漏和易引起肥厚性瘢痕增生等。尤其是隨著愈合的進(jìn)展,如何快速有效地促進(jìn)創(chuàng)面閉合的同時(shí)減少瘢痕的形成已成為大家重要的關(guān)注點(diǎn)。自1998年以來,FDA批準(zhǔn)纖維蛋白粘合劑(FS)在美國使用。之后其被臨床廣泛應(yīng)用于封閉和粘合,并且不斷推出新產(chǎn)品適用于新的適應(yīng)癥。隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和對(duì)敷料的嚴(yán)謹(jǐn)性越來越高,具有可降解性和良好生物相容性的纖維蛋白粘合劑已成為粘合封閉創(chuàng)面的首選之一。然而目前國內(nèi)上市的纖維蛋白粘合劑主要的臨床適應(yīng)癥均為止血作用而非粘合作用,因此本研究在成功研發(fā)一款新型豬源纖維蛋白粘合劑基礎(chǔ)上,圍繞該粘合劑對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合的作用效果及其機(jī)制進(jìn)行一系列的研究,旨在確定該粘合劑對(duì)皮膚愈合的療效,初步驗(yàn)證其粘合效果,為該粘合劑在臨床上應(yīng)用于皮膚創(chuàng)面治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.CCK-8法檢測豬源纖維蛋白粘合劑對(duì)L929和HUVECs細(xì)胞毒性研究;通過顯微鏡觀察細(xì)胞生長形態(tài)進(jìn)一步驗(yàn)證豬源纖維蛋白粘合劑對(duì)細(xì)胞毒性作用;采用Hoechst/PI雙染法進(jìn)一步探究豬源纖維蛋白粘合劑對(duì)L929和HUVECs細(xì)胞凋亡的影響。2.通過在SD大鼠背部處皮膚構(gòu)建一道長為4 cm的全層刀傷模型,給予不同處理方法。通過愈合組織部位拉伸強(qiáng)度,HE染色和Masson三色染色探究豬源纖維蛋白粘合劑對(duì)其愈合效果。3.通過Q-PCR和Western Blot從分子和蛋白水平探究豬源纖維蛋白粘合劑促進(jìn)創(chuàng)口愈合機(jī)制研究。結(jié)果:1.豬源纖維蛋白粘合劑浸提液分別作用于L929和HUVECs細(xì)胞24 h、48 h和72 h后,L929細(xì)胞存活率分別為84.64±1.66、81.97±0.31和83.98±2.42,其存活率低于空白對(duì)照組(P0.05)。而豬源纖維蛋白粘合劑浸提液對(duì)HUVECs細(xì)胞在24 h、48 h和72 h時(shí)細(xì)胞存活率分別為98.76±6.07、96.80±1.88和88.74±2.21,由此可得豬源纖維蛋白粘合劑浸提液處理HUVECs細(xì)胞24 h、48 h后對(duì)細(xì)胞并沒有顯著性影響,但在72 h時(shí)其存活率低于空白對(duì)照組(P0.05)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)粘合劑浸提液的細(xì)胞毒性進(jìn)行判定,豬源纖維蛋白粘合劑細(xì)胞毒性為0-1級(jí)別,毒性較小。通過顯微鏡觀察進(jìn)一步驗(yàn)證了豬源纖維蛋白粘合劑對(duì)L929和HUVECs細(xì)胞形態(tài)結(jié)果顯示其對(duì)細(xì)胞生長形態(tài)沒有顯著性影響。深入驗(yàn)證豬源纖維蛋白粘合劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響可發(fā)現(xiàn)豬源纖維蛋白粘合劑浸提液處理細(xì)胞24 h后,細(xì)胞凋亡不明顯,與對(duì)照組沒有顯著性差異。進(jìn)一步提示了豬源纖維蛋白粘合劑毒性較小,具有良好的生物相容性。2.建立SD大鼠背部皮膚創(chuàng)傷愈合模型,通過其愈合組織拉伸強(qiáng)度初步判斷其傷口愈合速度,結(jié)果提示了在愈合初期開始時(shí)豬源纖維蛋白粘合劑對(duì)傷口愈合起了促進(jìn)的效果。接著對(duì)傷口愈合部位進(jìn)行HE和Masson染色從病理形態(tài)上驗(yàn)證了豬源纖維蛋白粘合劑能夠較快地促進(jìn)表皮再上皮化和膠原沉積從而促進(jìn)傷口的愈合。3.采用Q-PCR實(shí)驗(yàn)探究豬源纖維蛋白粘合劑對(duì)與促進(jìn)皮膚愈合的VEGFA mRNA、bFGF mRNA、CollagenⅠmRNA和TGF-β1 mRNA表達(dá)影響和應(yīng)用Western Blot探究豬源纖維蛋白粘合劑對(duì)VEGFA、bFGF、CollagenⅠ、TGF-β1和α-SMA蛋白的表達(dá)影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Q-PCR結(jié)果與Western Blot結(jié)果幾乎一致,在愈合初期,豬源纖維蛋白粘合劑通過上調(diào)bFGF、VEGFA和α-SMA而促進(jìn)了傷口愈合,同時(shí)下調(diào)了與瘢痕相關(guān)的CollagenⅠ、TGF-β1蛋白表達(dá)。在愈合重塑期,豬源纖維蛋白粘合劑組及時(shí)促進(jìn)了成肌纖維細(xì)胞的凋亡,降低了α-SMA蛋白的表達(dá)。結(jié)論:豬源纖維蛋白粘合劑具有良好的生物相容性,能夠促進(jìn)皮膚傷口愈合。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96
【圖文】：

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文2.4.2 顯微鏡下觀察豬源纖維蛋白粘合劑對(duì) L929 和 HUVECs 生長狀態(tài)的影響觀察纖維蛋白粘合劑浸提液作用 24 h 后對(duì) L929 細(xì)胞的生長狀態(tài)的影響，結(jié)果如圖 2-2。對(duì)照組和纖維蛋白粘合劑組的細(xì)胞均生長良好，形態(tài)分明，且分布較密集。但是纖維蛋白粘合劑細(xì)胞數(shù)量略少于對(duì)照組。而對(duì)于 HUVECs 細(xì)胞中，對(duì)照組與纖維蛋白粘合劑組中細(xì)胞數(shù)量差異不明顯，細(xì)胞生長狀態(tài)均良好，輪廓清晰，見圖 2-3。（a）（b）

見圖 2-3。圖 2-2 豬源纖維蛋白粘合劑浸提液對(duì) L929 細(xì)胞生長狀態(tài)的影響(×100)（a）對(duì)照組；（b）豬源纖維蛋白粘合劑Fig.2-2 Effect of PFS extract on the growth status of L929 cells(×100)（a）control group；（b）PFS group（a）（a）（b）（b）

為了驗(yàn)證豬源纖維蛋白粘合劑浸提液分別作用于 L929 和 HUVECs 細(xì)胞是否具有促進(jìn)凋亡作用，采用 Hoechst/PI 雙染法檢測豬源纖維蛋白粘合劑浸提液對(duì)L929 和 HUVECs 細(xì)胞凋亡影響。Hoechst 是具有穿透細(xì)胞膜的能力，且對(duì)細(xì)胞活性影響較小的在紫外光激發(fā)下顯示藍(lán)色的熒光染料。在熒光顯微鏡下正常的細(xì)胞顯示出弱淡藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞因其染色質(zhì)會(huì)固縮從而在熒光顯微鏡下顯示出亮藍(lán)色[75]。PI 只能穿透無完整性細(xì)胞膜的壞死細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞從而在熒光顯微鏡下顯示出紅色。Hoechst 陰性和 PI 陰性為正�；罴�(xì)胞，Hoechst 陽性和 PI陰性為凋亡細(xì)胞，Hoechst 陰性和 PI 陽性為壞死細(xì)胞。豬源纖維蛋白粘合劑浸提液分別作用于 L929 和 HUVECs 細(xì)胞 24 h 后，細(xì)胞的凋亡形態(tài)見圖 2-4 和圖 2-5。無論在空白對(duì)照組和豬源纖維蛋白粘合劑組中，細(xì)胞染色均勻發(fā)出淡藍(lán)色熒光，早期凋亡細(xì)胞較少且與空白對(duì)照組無明顯差異，顯示了豬源纖維蛋白粘合劑浸提液無促凋亡作用，再一次驗(yàn)證了豬源纖維蛋白粘合劑浸提液對(duì) L929 和 HUVECs細(xì)胞無毒性或毒性較小。Hoechst PI Mergea）

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本文編號(hào)：2752334