【摘要】：目的:促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞攝取、呈遞腫瘤抗原,是構(gòu)建腫瘤疫苗需要考慮的重要因素。單純的腫瘤抗原免疫原性差,采用合適的負(fù)載體系對于增強(qiáng)抗原的攝取、提呈,特別是誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答是非常重要的。本文通過多酚金屬的絡(luò)合作用,以單個細(xì)胞為模版,構(gòu)建了負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的微顆粒體系,該體系能夠有效刺激抗原提呈細(xì)胞對腫瘤抗原的吞噬提呈并激活細(xì)胞免疫反應(yīng)。本工作提供了一種通用、簡單、有效的腫瘤抗原包封策略,將單個腫瘤細(xì)胞包埋得到腫瘤疫苗,可以用于個體化免疫治療。方法:通過透射電鏡,掃描電鏡,共聚焦顯微鏡觀察TCL@EGCG/AIn微顆粒結(jié)構(gòu);利用X射線光電子能譜(XPS)及X射線能譜(EDS)檢測其組成成分;利用BCA法測定TCL@EGCG/AIn的蛋白負(fù)載能力及在不同pH環(huán)境下的蛋白釋放情況;通過激光共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy,LSCM)及流式細(xì)胞技術(shù)(Fluorescence Activated Cell Sorter,FACS)分析 DC 細(xì)胞對 TCL@EGCG/AIn的攝取;通過活體成像觀察TCL@EGCG/AIn負(fù)載的抗原蛋白在體內(nèi)的遷移情況;采用流式細(xì)胞儀檢測TCL@EGCG/AIn促進(jìn)骨髓來源樹突狀細(xì)胞成熟的能力;通過動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察其預(yù)防治療以及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效果。結(jié)論:成功制備了 EGCG/AI包裹腫瘤細(xì)胞裂解物的微顆粒疫苗,并確定了其形貌成球狀。該微顆粒疫苗具有較高的蛋白負(fù)載量及pH響應(yīng)性蛋白釋放特性,在pH 5.5時釋放較快。細(xì)胞毒性結(jié)果顯示該具有良好的生物相容性,可以被BMDCs細(xì)胞攝取,并活化刺激BMDCs成熟。皮下注射微顆粒疫苗后6 h遷移至淋巴結(jié),48小時內(nèi)熒光不消失。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該微顆粒疫苗在一定程度上可以預(yù)防和抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R943;R730.51
【圖文】：

（ｄ）為低倍鏡下ＳＥＭ圖像�？梢钥闯觯裕茫蹋溃牛牵茫牵粒保∥㈩w粒表面有塌陷現(xiàn)象，逡逑而ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微顆粒沒有，球形結(jié)構(gòu)完整，說明ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微顆粒更穩(wěn)逡逑定。圖２－２（ｅ）（ｆ）為Ｂ１６細(xì)胞ＳＥＭ圖像，從圖中可以看出，Ｂ１６細(xì)胞表面光滑；逡逑與Ｂ１６細(xì)胞相比，微顆粒形貌成球形，表面粗糙，直徑約為７邋ｎｍ，略小于Ｂ１６細(xì)逡逑胞。ＳＥＭ在真空條件下進(jìn)行，表明ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微顆粒具有良好的物理穩(wěn)定性。逡逑圖２－３為Ｂ１６細(xì)胞與ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微顆粒的ＴＥＭ超薄切片圖，從圖中可以看逡逑出，微顆粒表面有一層連續(xù)致密層包裹，與Ｂ１６細(xì)胞表面有明顯區(qū)別。逡逑１８逡逑

圖２－４邋（ａ）邋（ｂ）分別為ＦＩＴＣ、ＤＡＰＩ標(biāo)記的Ｂ１６細(xì)胞（ａ）和ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａｂ微顆粒（ｂ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４邋ＣＬＳＭ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋Ｂ１６邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｅｆｏｒｅ邋（ａ）邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ邋（ｂ）邋ｃｏａｔｉｎｇ邋ｂｙ邋ＥＧＣＧ／Ａ１邋ｌａｙｅｒ．逡逑由圖２－５邋Ｂ１６細(xì)胞與ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微顆粒的ＸＰＳ和ＥＤＳ圖譜可知，逡逑ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａｌ３邋由邋Ｃ、Ｎ、０、Ｎ、Ｓ、ＡＩ邋元素組成。對比邋Ｂ１６邋細(xì)胞與邋ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａｌ３逡逑的圖譜，ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３的ＸＰＳ和ＥＤＳ圖譜有ＡＩ元素的存在，而Ｂ１６無ＡＩ元逡逑素。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果都證明了邋ＥＧＣＧ／ＡＩ結(jié)構(gòu)的形成。逡逑Ｖａ；邋Ｃｌｓ邋８１．５０邐Ｗ邋ＣＩＳ邋６０．４３邋ｇ邋0逡逑廣ｖ邐Ｎｌｓ邐３．７４邐一邐Ｎｌｓ邐１８．１０逡逑＾邐Ｏｌｓ邐１３．３８邐２邐０１ｓ邐１８．６９逡逑３邐Ｐ２ｐ邐１．１１邐？邐Ｓ邐：ｄ邐Ａ１２ｐ邐１．０５逡逑ｔ邋＿邋」％邋０．２６邋°邋ｔ邋＃rP常rP櫻rP玻]3?Ｉ邋ｙｉ邋0邐？邋ＩＡＪ邐ｔ逡逑工邋ａ邐１邋一Ｈ逡逑＼＼邋ｏｐ邋Ｑ－邋0邐１邐ｃ／）0－＜Ｖ逡逑ｉ邐，邐ｉ邋■邋ｉ邋■邋ｉ邐，邐ｉ邐＇邐ｒ＊邐＊■邋ｉ－邐＞．邐邐ｉ邋■邐｜邐．邋ｉ邐，邐ｉ邐ｉ邋．Ｕ■—產(chǎn)？▲、逡逑１２００邋１０００邐８００邐６００邐４００邐２００邐０邐１２００邐１０００邐８００邐６００邐４００邐２００邐０逡逑Ｂｉｎｄｉｎｇ邋Ｅｎｅｒｇｙ邋（ｅＶ）邐Ｂｉｎ?

ｕｍｍｍ逡逑■■W逡逑圖２－６四種腫瘤細(xì)胞與其經(jīng)過ＥＧＣＧ／ＡＩ包裹后ＳＥＭ圖像逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－６邋ＳＥＭ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋４Ｔ１．邋ＣＴ２６，邋ＭＢ４９邋ａｎｄ邋ＨＬ－６０邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｃｏａｔｉｎｇ邋ｂｙ邋ＥＧＣＧ／Ａ１逡逑ｌａｙｅｒ．邋Ｕｎｃｏａｔｅｄ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｆｉｘｅｄ邋ｂｙ邋ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ邋ｆｏｌｌｏｗｅｄ邋ｂｙ邋ｗａｓｈｉｎｇ邋ｗｉｔｈ邋ｈｉｇｈ－ｐｕｒｉｔｙ邋ｗａｔｅｒ．逡逑為了驗(yàn)證這種方法的通用性，我們嘗試了用另外三種鼠源腫瘤細(xì)胞：小鼠乳腺逡逑癌細(xì)胞（４Ｔ－１）、小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞（ＣＴ－２６）、小鼠膀胱癌細(xì)胞（ＭＢ４９），一種人源腫逡逑瘤細(xì)胞：人急性早幼粒白血病細(xì)胞（ＨＬ－６０），以及一種鼠源非腫瘤細(xì)胞？．小鼠樹突逡逑狀細(xì)胞（ＤＣ邋２．４）進(jìn)行包裹，并通過掃描電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察其形逡逑２１逡逑

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本文編號：2752100