【摘要】：研究背景及目的:大氣污染對公眾健康的危害近年來引起了人們極大的重視。研究表明其中粒徑小于2.5μm的微小顆粒物(fine particle matter,PM2.5)是造成危害的主要污染物~([1])。PM2.5不單能夠經(jīng)由呼吸道進入肺泡引起肺系疾病~([2]),進入肺泡后還可透過肺泡壁進入血液循環(huán),可致使以肺及心血管系統(tǒng)為代表的多個系統(tǒng)產(chǎn)生疾病~([3])。PM2.5引發(fā)心血管疾病發(fā)病率及死亡率的增高和PM2.5加速動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)關(guān)系密切。PM2.5進入人體后可使血管內(nèi)皮細胞氧自由基的表達增多,使細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài),氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并且致使內(nèi)皮細胞受損,進而導(dǎo)致以AS為代表的多種心血管疾病的產(chǎn)生。本課題組前期研究結(jié)果得出PM2.5作用于人血管內(nèi)皮細胞會引起細胞的凋亡,并證明氧化應(yīng)激介導(dǎo)該進程~([4])。有研究顯示,持續(xù)或過強的氧化應(yīng)激能夠使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反應(yīng)激活,二者還有相互促進的作用,循環(huán)放大反應(yīng)進而加速細胞凋亡~([5-6])。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是各種因素致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時產(chǎn)生的一種具有雙向效應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng),早期可保護細胞減輕損害,應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)則其最終結(jié)果可致使細胞凋亡~([7]),且細胞的穩(wěn)態(tài)與通透性變化關(guān)系密切。在此基礎(chǔ)上,我們有理由相信,PM2.5可能經(jīng)由激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)機制引發(fā)內(nèi)皮細胞凋亡并致使內(nèi)皮細胞通透性發(fā)生改變。白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種對多種疾病多個系統(tǒng)有廣泛藥理作用的一類多酚類活性物質(zhì),其中在心血管系統(tǒng)疾病方面的藥理作用尤其明顯~([8])。我們前期試驗證實白藜蘆醇可以通過緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)來保護PM2.5引起的內(nèi)皮細胞凋亡~([4])。本實驗將在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來研究PM2.5引起血管內(nèi)皮細胞凋亡的機制,并進一步研究白藜蘆醇對PM2.5誘導(dǎo)的EA.hy926細胞凋亡和通透性的改變的影響,探討白藜蘆醇對心血管系統(tǒng)的保護作用及其可能機制,為白藜蘆醇用于治療和預(yù)防PM2.5致使的心血管疾病及其相干并發(fā)癥提供實驗根據(jù)。方法:1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在PM2.5誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡中的影響:(1)EA.hy926細胞分為空白對照組、PM2.5不同濃度組(PM2.5終濃度分別為25、50、100、200μg·mL~(-1)),通過qRT-PCR法檢測各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78、XBP1、CHOP的mRNA表達情況,通過蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測PM2.5對EA.hy926細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、XBP1、PERK、ATF4、CHOP表達的影響。(2)設(shè)置對照組、PM2.5組(用PM2.5 100μg·mL~(-1)處理)、control-siRNA組、control-siRNA+PM2.5組(轉(zhuǎn)染control-siRNA后用PM2.5進行干預(yù))、si-PERK組、si-CHOP組和si-JNK組(分別轉(zhuǎn)染對應(yīng)的siRNA),si-PERK+PM2.5組、si-CHOP+PM2.5組和si-JNK+PM2.5組(分別轉(zhuǎn)染對應(yīng)的siRNA,再用PM2.5進行干預(yù)),處理EA.hy926細胞24h后,用Western blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子PERK、CHOP蛋白的表達變化。用qRT-PCR法檢測各組細胞PERK、CHOP、JNK mRNA的表達情況,用流式細胞術(shù)通過Annexin V-FITC/PI雙染后檢測各組細胞凋亡的變化。(3)分為空白對照組、PM2.5組(用PM2.5 100μg·mL~(-1)處理)、4PBA組、4PBA組+PM2.5組(用終濃度為1mmol·L~(-1)的4PBA預(yù)處理1 h再給予100μg·mL~(-1)的PM2.5),24小時后使用流式細胞儀通過Annexin V-FITC/PI雙染觀察各組凋亡的變化。2.PM2.5誘導(dǎo)EA.hy926細胞通透性改變影響:(1)將狀態(tài)良好的EAhy926細胞接種于Transwell板上,每12h測細胞跨膜電阻(TEER)并記錄數(shù)值,連續(xù)兩次數(shù)值相近時細胞間為形成緊密鏈接。(2)EA.hy926細胞接種待形成緊密連接后分為對照組、PM2.5不同濃度組(終濃度分別為50、100、200μg·mL~(-1)),Millicell ERS-2細胞電阻儀檢測各組細胞跨膜電阻值(TEER)的變化。(3)待EA.hy926細胞成緊密單層后,分為對照組、PM2.5組(用PM2.5 100μg·mL~(-1)處理)、4PBA組、4PBA組+PM2.5組(用終濃度為1 mmol·L~(-1)的4PBA預(yù)處理1 h再給予100μg·mL~(-1)的PM2.5),用Millicell ERS-2檢測24小時各組的跨細胞膜電阻值。3.白藜蘆醇對PM2.5導(dǎo)致的EA.hy926通透性和細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響:EA.hy926細胞分為對照組、PM2.5組(終濃度為100μg·mL~(-1))、PM2.5組+RES低濃度組(終濃度為5μmol·L~(-1)的白藜蘆醇預(yù)處理1h后給以PM2.5終濃度為100μg·mL~(-1))、PM2.5組+RES中濃度組(終濃度為10μmol·L~(-1)的白藜蘆醇預(yù)處理1h后給以PM2.5終濃度為100μg·mL~(-1))、PM2.5組+RES高濃度組(終濃度為20μmol·L~(-1)的白藜蘆醇預(yù)處理1h后給以PM2.5終濃度為100μg·mL~(-1)),用Millicell ERS-2細胞電阻儀檢測并記錄各組的細胞跨膜電阻值變化,qRT-PCR法檢測各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)mRNA GRP78、XBP1、CHOP的表達情況,用Western Blot檢測PM2.5對EA.hy926細胞XBP1、GRP78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表達程度的影響。4.白藜蘆醇對PM2.5誘導(dǎo)的EA.hy926細胞miRNA差異表達的研究:EA.hy926細胞分為對照組、PM2.5終濃度100μg·mL~(-1)組,白藜蘆醇+PM2.5組(終濃度為20μmol·L~(-1)的白藜蘆醇預(yù)處理1h后給以PM2.5終濃度為100μg·mL~(-1)),刺激24小時后提取細胞RNA,進行microRNA測序,對表達差異的miRNA進行驗證和功能研究。結(jié)果:1.(1)與對照組比較,PM2.5濃度25、50,、100、200μg·mL~(-1)組細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)GRP78、XBP1、CHOP mRNA隨PM2.5濃度升高而表達上升,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)GRP78、XBP1、PERK、ATF4、CHOP蛋白表達隨PM2.5濃度升高而表達上升,且均具有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)與PM2.5濃度100μg·mL~(-1)組比較,轉(zhuǎn)染PERK siRNA、CHOP siRNA組PERK、CHOP蛋白質(zhì)表達均下降,轉(zhuǎn)染PERK siRNA、CHOP siRNA組的細胞凋亡率均下降且均具有統(tǒng)計學(xué)意義,轉(zhuǎn)染JNKsiRNA組細胞的凋亡有所下降,但無統(tǒng)計學(xué)意義。(3)與PM2.5濃度100μg·mL~(-1)組比較,4PBA預(yù)處理組的凋亡率明顯下降,具有統(tǒng)計學(xué)意義。2.與對照組比較,PM2.5不同濃度組TEER值表達均明顯下降,與PM2.5(100μg·mL~(-1))組比較,4BPA+PM2.5(100μg·mL~(-1))組TEER值表達明顯上升。3.與PM2.5組比較,不同濃度RES預(yù)處理組TEER值均上升且具有統(tǒng)計學(xué)意義;GRP78、XBP1、CHOP mRNA的表達均下降具有統(tǒng)計學(xué)意義。GRP78、XBP1、PERK、ATF4、CHOP蛋白表達表達均下降具有統(tǒng)計學(xué)意義。4.經(jīng)過miRNA表達差異分析及驗證,與對照組相比,PM2.5組miR-1246明顯上升,與PM2.5組相比,has-miR-1246-micmics+PM2.5組凋亡率增高,而has-miR-1246-inhibitor+PM2.5組細胞凋亡率下降,說明miR-1246介導(dǎo)了PM2.5誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡;白藜蘆醇預(yù)處理組和PM2.5組比較,miR-1246表達明顯下降,結(jié)果提示白藜蘆醇干預(yù)PM2.5引起的凋亡與hsa-miR-1246密切相關(guān)。結(jié)論:1.PM2.5可能通過影響激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑引發(fā)EA.hy926細胞凋亡和通透性改變。2.白藜蘆醇預(yù)處理可明顯抑制PM2.5引起的EA.hy926細胞通透性改變及凋亡,發(fā)揮保護作用,這可能是通過干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑發(fā)揮作用的。3.白藜蘆醇可通過調(diào)控miR-1246的表達來影響PM2.5引起的EA.hy926細胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R994.6
【圖文】：

廣州中醫(yī)藥大學(xué) 2018 屆碩 學(xué)位論文6.2 PM2.5 引起 EA.hy926 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)表達的影響如圖 2 所示，與對照組比較，PM2.5 25、50、100、200μ g mL-1濃度組 GRP1、PERK、ATF4、 CHOP 表達均明顯上升(p ＜0.05)，此結(jié)果提示 PM2.5 可內(nèi)皮細胞 EA.hy926 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急途徑激活。

PM2.5 影響內(nèi)皮細胞凋 和通透性的機制及白藜蘆醇干預(yù)研究2.2.5.3 Western blot 檢測白藜蘆醇對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑相關(guān)蛋白質(zhì)的表達如圖 12 所示，與對照組比，PM2.5 組 GRP78、PERK、ATF4、 CHOP 表達均升(p＜0.05)，與 PM2.5 組相比，白藜蘆醇不同濃度預(yù)處理均能使 GRP78、PERK、ATFCHOP 表達下降(p＜0.05)，提示白藜蘆醇對 PM2.5 引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急途徑激活有抑作用。

【參考文獻】

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本文編號：2751767