發(fā)布時間：2020-07-12 05:33

【摘要】：第一部分:抗癲癇藥物新方法的開發(fā)與驗證卡馬西平背景:卡馬西平復雜的藥代動力學特征導致血漿濃度個體差異較大,需要常規(guī)監(jiān)測其藥物濃度,以確保其有效性、安全性并減少不良反應的發(fā)生。目的:本研究旨在建立并驗證一種更簡便、快速、準確、靈敏、經濟有效、新穎的液相色譜質譜聯(lián)用(LC/MS)檢測方法以提供快速,準確和可靠的卡馬西平血漿藥物濃度檢測結果。方法:為此測定方法選擇的流動相是乙酸銨(5mM),甲醇(40:60v/v)。使用安捷倫LC/MS系統(tǒng)。為了分離分析物,選擇了 Diamonsi1 C18柱(150mmX 4.6mm,5μm)。103份血樣本均來自山東大學齊魯醫(yī)院接受卡馬西平常規(guī)治療的癲癇患者,采用LC/MS分析方法測定卡馬西平血漿濃度。選擇簡單的蛋白質沉淀方法提取分析物。結果:線性方程為y = 2.44516x + 0.00348175,相關系數(R2)為0.99881,線性范圍為5-1000ng/ml。結果顯示,所有進行的分析驗證參數均在國際協(xié)調指導原則的公認范圍內。結論:一種簡單,快速,準確,靈敏,經濟有效,新穎和精確的LC/MS方法得以開發(fā)和發(fā)展,其具有簡單的提取過程,較少的血漿體積和較低的定量限,可用于103例癲癇患者的卡馬西平的藥物監(jiān)測。該測定技術也可用于其他臨床應用,如藥代動力學,毒代動力學和生物等效性研究。苯妥英鈉背景:苯妥英鈉具有治療窗窄和非線性藥代動力學特征,吸收不規(guī)則,劑量與濃度不可預測,同時由于多種藥物同時應用存在的顯著的藥物相互作用,常規(guī)的血藥濃度監(jiān)測對于癲癇患者的個體化治療和維持治療尤為重要。苯妥英鈉血濃度監(jiān)測很難同時做到簡單、快速、精確、易行、經濟、高效且靈敏,目前所用檢測方法耗時、復雜而且昂貴,另一方面,簡便、快速且經濟的分析方法又難以兼顧準確度和靈敏度。醫(yī)生和患者需要等待很長時間才能獲得可靠的苯妥英鈉濃度監(jiān)測數據,用于臨床決策。而合理且及時的治療決策對于癲癇患者至關重要。目的:本研究旨在建立并驗證一種快速簡便、準確、高度靈敏、經濟易行的液相色譜-質譜聯(lián)用檢測方法,以提供快速,準確和可靠的苯妥英藥物濃度結果。方法:使用安捷倫LC/MS系統(tǒng)。流動相的混合物是乙酸銨(5Mm):比例為(35:65v/v)的甲醇。通過簡單的蛋白沉淀法在Diamonsil C18(150mmX 4.6mm,5 μm)柱上提取血漿中的分析物。共收到27份血液樣本,用于苯妥英藥物監(jiān)測。血液樣本為濟南齊魯醫(yī)院的27例癲癇患者。。結果:在0.2～20μg/mL的濃度范圍時,(R2)0.999,可以獲得優(yōu)異的線性曲線。結果顯示,所有進行的分析驗證參數均在國際協(xié)調指導原則的公認范圍內。結論:一種簡單,快速,低成本,精確,新穎,極其靈敏,易于使用的LC/MS技術建立起來,并已在苯妥英TDM中進行了驗證和高效應用。令人驚訝的是,觀察到幾乎所有患者的苯妥英血漿結果均超出參考范圍,但兩名患者除外;其苯妥英血漿濃度在參考范圍內。但是需要進一步調查。該方法快速可靠。醫(yī)生和臨床醫(yī)生可以隨時獲得治療藥物監(jiān)測結果,以便做出理智快速的決定,更重要的是由于神經科醫(yī)師的合理決定;癲癇患者可以以最小的苯妥英監(jiān)測成本成功控制疾病癥狀,避免因為不可靠和不必要的重復藥物監(jiān)測過程來醫(yī)院的不必要訪問。該測定方法也可用于其他臨床應用,如藥代動力學,毒代動力學和生物等效性研究。拉莫三嗪背景:拉莫三嗪濃度水平和相關的臨床毒性峰值可能出現(xiàn)不可預測的情況目的:本研究旨在建立并驗證一種簡單、敏感、快速、準確和經濟的高壓液相色譜-紫外檢測方法,并常規(guī)用于癲癇患者拉莫三嗪血漿濃度測定。方法:采用高效液相色譜法(HPLC)測定常規(guī)接受拉莫三嗪治療的癲癇患者血濃度。采用甲醇沉淀蛋白方法,以Diamonsil C18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm,Waters-Milford,MA,United States.),以 0.1%三氟乙酸鹽和甲醇(59:41,v:v)為流動相,流速為1.5ml/min,檢測波長為260nm。結果:拉莫三嗪在1.0-50 μg/mL濃度范圍呈現(xiàn)良好的線性關系(r2 =0.9961),定量下限為1.0 μg/ml。所有分析驗證參數均在ICH(International Conference on Harmonisation)準則的可接受范圍內。結論:本研究建立了簡單、靈敏、快速和適用性良好的高效液相分析方法,并用于67份癲癇患者血漿拉莫三嗪濃度的監(jiān)測。該方法可用于拉莫三嗪的常規(guī)治療藥物監(jiān)測,也可用于拉莫三嗪的生物等效性研究、藥代動力學研究、毒代動力學研究和藥物警戒研究。左乙拉西坦背景:左乙拉西坦為抗癲癇藥物,具有嚴重的臨床毒性,可造成左乙拉西坦血濃度相關性紅細胞和嗜中性粒細胞和紅細胞壓積計數減少,以及無力、嗜睡和頭暈等。常規(guī)監(jiān)測左乙拉西坦血濃度,有助于提高治療效應,降低無效治療和毒性治療的發(fā)生率。目的:本研究旨在開發(fā)和驗證一種簡便、快速、可靠、經濟、靈敏和準確的高壓液相色譜-紫外檢測方法,用于檢測常規(guī)接受左乙拉西坦治療的癲癇患者左乙拉西坦血漿濃度。方法:流動相為磷酸二氫鈉(0.2mol/L,pH4.5)和乙腈以90:10(體積/體積)混合,流速為1.2ml/min,波長為210nm,色譜柱為Diamonsil C18(5μm,200mm×4.6mm,Waters-Milford,MA,US)。采用液液萃取法提取血漿左乙拉西坦,以咖啡因為內標。方法的特異性、回收率、準確度和精密度、穩(wěn)定性驗證均符合ICH(International Conference on Harmonisation)Q2(B)指導原則。結果:左乙拉西坦在1-160μg/mL濃度范圍內線性關系良好,相關系數為0.9990,定量下限為1μg/mL。提取效率左乙拉西坦為80%,內標為101%。穩(wěn)定性結符合要求。結論:建立了用于定量測定人血漿中左乙拉西坦?jié)舛鹊暮唵�、可靠、高靈敏度、經濟和快速的測定技術,并對方法進行驗證。該方法可用于常規(guī)測定癲癇患者血漿中的左乙拉西坦,還可用于左乙拉西坦的生物等效性研究、藥代動力學研究、毒代動力學研究和藥物警戒研究等其他臨床應用。第二部分:現(xiàn)代方法(酶倍增免疫分析技術;EMIT)用于TDM的卡馬西平和苯妥英的開發(fā)和驗證的LC/MS方法的相關性評估卡馬西平背景:卡馬西平具有可變的藥代動力學特征,這可能容易引起卡馬西平血漿水平的變化。因此,為了獲得最大效力,安全性和避免毒性,需要對藥物濃度進行常規(guī)測定。已經報道了許多精確和高靈敏度的色譜技術用于卡馬西平的治療監(jiān)測,但是這些測定方法是復雜且昂貴的。免疫分析技術如酶復合免疫分析技術簡單,快速且易于操作。它們經常用于卡馬西平的常規(guī)治療監(jiān)測。目的:目前的工作旨在評估LC/MS技術與EMIT在癲癇患者血液中常規(guī)藥物監(jiān)測卡馬西平的相關性。方法:分別采用LC/MS技術和EMIT技術,檢測103個接受卡馬西平治療的癲癇患者血樣本卡馬西平血漿濃度。分別采用MedCalc和SPSS軟件獲得回歸方程和bland-altman圖,分析LC/MS技術和EMIT技術所測卡馬西平血濃度數據的相關性。結果:LC/MS方法與EMIT的相關性良好(R2=0.971),酶倍增免疫技術卡馬西平血濃度數據略高于LC/MS卡馬西平血濃度數據。結論:本研究對LC/MS方法與EMIT方法所測的卡馬西平血濃度數據相關性進行了驗證和比較。兩種檢測方法間無顯著性差異,LC/MS方法與EMIT之間有良好的相關性。作為金標準的液相色譜-質譜技術所測結果更準確且更易被接受。但酶倍增免疫測定技術更簡單、便捷,檢測結果當天即可得出,適用于卡馬西平的常規(guī)藥物監(jiān)測。苯妥英背景:苯妥英是治療范圍較窄的藥物。有強有力的證據顯示苯妥英引起的危及生命和危險的皮膚不良反應,這在中國人群中經常報道,這表明中國人在使用苯妥英時出現(xiàn)更嚴重的不良反應的風險較高。目的:本研究旨在評估色譜-質譜法(LC/MS)與免疫分析法(EMIT)所測癲癇患者苯妥英血濃度測定的相關性,為實施苯妥英常規(guī)治療的臨床醫(yī)生制定、調整、修飾給藥方案提供決策依據。方法:本研究共收集27例癲癇患者血漿樣本,分別采用所建立的LC/MS和EMIT技術測定苯妥英血濃度。分別采用MedCalc和SPSS軟件獲得回歸方程和bland-altman圖,分析LC/MS技術和EMIT技術所測卡馬西平血濃度數據的相關性。所有樣本均在山東大學齊魯醫(yī)院收集,研究工作在赫爾辛基宣言進行。結果:分別得到0.2-20 μ g/mL液相色譜/質譜法和2.5-40 μ g/mL酶擴增免疫分析技術的良好線性曲線。色譜的相關性;帶免疫測定的LC/MS;EMIT法測定苯妥英鈉含量較好(R2 = 0.921)。通過酶-倍增免疫測定技術測定的苯妥英血漿濃度略低于液相色譜/質譜法。95%置信區(qū)間為-21.4～14.3 ug/mL。兩種技術的差異并不重要(P0.05)。這兩種方法都適用于確定癲癇患者的苯妥英濃度。。結論:兩種檢測方法的具有良好相關性,液相色譜/質譜測定的苯妥英濃度略高于酶放大免疫測定技術的檢測值。與兩種測定技術原理不同有關,其臨床意義有待進一步評價。第三部分:應用TDM評估卡馬西平,苯妥英鈉和丙戊酸對中國癲癇患者不同年齡和性別的臨床反應,依從性,安全性和毒性卡馬西平背景:卡馬西平通常由神經精神科醫(yī)生開具處方供癲癇患者使用的抗癲癇藥物。其顯著的的遺傳差異、性別、年齡和種族對卡馬西平血漿水平及其代謝產物的影響已得到公認。目的:卡馬西平通常由神經病學家處方并建議癲癇患者使用抗癲癇藥物,并且遺傳差異,性別,年齡和種族對卡馬西平血漿水平及其代謝產物的影響已得到公認。這項工作的目的是量化卡馬西平血藥濃度,并根據卡馬西平的治療藥物監(jiān)測結果評估和比較中國癲癇患者不同年齡和性別組的臨床反應,依從性,安全性和毒性,因為漢族-當暴露于卡馬西平時,中國人更容易發(fā)生嚴重和致命的副作用。方法:采用經驗證的方法對卡馬西平治療的癲癇患者血漿濃度進行測定,并將測定結果匯總,評估、比較中國癲癇患者中不同年齡和性別人群的順應性、安全性和毒性。將治療藥物監(jiān)測結果按男性和女性分別分組,然后將每個性別組進一步分為兒童、成人和老年人的不同年齡組。分析、評估性別組、性別組內所有年齡組治療范圍、亞治療范圍和毒性范圍。結果:研究結果顯示,總樣本中有45%的樣本處于亞治療水平,55%的樣本卡馬西平濃度水平處于治療水平,所有性別和年齡組均未出現(xiàn)毒性水平。與男性相比,女性樣本處于的亞治療水平的人數更多。與成人和老年男性及成人和老年女性相比,男性兒童和女性兒童人群均有更多的人數處于亞治療水平。但仍需更大樣本的進一步評估。結論:本研究結果顯示,大部分卡馬西平血漿濃度結果的患者樣本處于亞治療水平,并且在這些患者中發(fā)現(xiàn)有不適的臨床反應。建議必須常規(guī)監(jiān)測卡馬西平血濃度,并且只有在治療藥物監(jiān)測結果出現(xiàn)后才能對癲癇患者的卡馬西平給藥劑量進行調整,以評估依從性,優(yōu)化療效,安全性并將毒性降至最低。苯妥英背景:苯妥英治療指數較窄,具有非線性藥代動力學特征,口服吸收不規(guī)則,給藥劑量和臨床效應間相關性不可預測,因此,須對癲癇患者實施苯妥英血漿濃度常規(guī)監(jiān)測。目的:本研究旨在對未受控制的癲癇發(fā)作,懷疑不遵醫(yī)囑服藥或有毒性反應的癲癇患者的苯妥英血漿濃度進行量化,以評估其依從性、安全性和毒性。方法:采用酶放大免疫測定技術對齊魯醫(yī)院神經內科提供的48例癲癇患者血樣本進行苯妥英血濃度監(jiān)測,包括對未受控制的癲癇發(fā)作或懷疑不遵醫(yī)囑服藥或有毒性反應的癲癇患者的苯妥英血濃度監(jiān)測。匯總所有患者苯妥英血濃度監(jiān)測結果,評估患者依從性、安全性和毒性。結果:令人驚訝的是,在接受苯妥英治療的癲癇患者中,大多數患者(85.5%)血漿濃度超出正常參考范圍,其中69%的樣本處于亞治療水平,16.5%的樣本處于毒性水平,僅14.5%的樣本苯妥英水平在正常參考范圍之內。苯妥英是狹窄治療指數的藥物。苯妥英具有非線性藥動學,不可預測的吸收,劑量和臨床應答之間的不可預測的鏈路,其支持用于定期確定癲癇患者苯妥英血漿濃度的需要。目的:本研究旨在量化苯妥英血漿藥物濃度,以確定它們與中國癲癇患者的不同性別和不同年齡組的臨床反應,不可控癲癇發(fā)作和毒性的可能關系。方法:齊魯醫(yī)院神經內科對48例癲癇持續(xù)發(fā)作或疑有不良反應的癲癇患者進行苯妥英藥物監(jiān)測。所有這些樣品用酶增殖免疫分析技術進行治療藥物監(jiān)測分析。結果:令人驚奇地發(fā)現(xiàn),大多數85.5%的樣品都是從基準范圍,該樣品的69%是在亞治療水平和樣品的16.5%的毒性水平和不利的臨床反應在這些患者中,注意到的。所有測試樣品中只有14.5%的苯妥英血漿濃度水平處于治療水平。苯妥英血漿濃度的差異在不同性別和不同年齡組顯著改變。與男性相比,與成人患者相比,女性和兒童患者樣本的參考值范圍增加。結論:該研究的結果表明,大多數患者的治療結果超出參考范圍,并且在這些患者中觀察到不利的臨床反應。我們推測,大多數這些患者的失控性癲癇發(fā)作或毒性和不良臨床反應可能是由于超出苯妥英的治療范圍,盡管其他因素如遺傳因素,遺傳多態(tài)性的變化,個體內和個體間藥代動力學變化參數,病理狀況,藥代動力學相互作用以及特定條件如妊娠和與藥物年齡有關的身體反應也可能導致血漿濃度和治療反應的變化。這些患者出現(xiàn)治療范圍的主要原因可能是依從性差,劑量不足,過量用藥或患者自身采取的不適當的自我劑量,導致血漿濃度超出參考范圍和不利的臨床反應。兒童和嬰兒是獨特的群體,因為代謝速度快,消除時間快,分配值的體積大,女性在懷孕期間代謝速度快,消除速度快。這些因素在兒童,嬰兒和女性中也可能是亞治療水平的原因。但是,所有這些因素都需要進一步的警惕評估。在解釋血漿濃度結果時,必須特別注意特定性別和特定年齡組,以便于修改劑量并開發(fā)最佳治療方法并獲得所需的臨床反應,因為多種因素可以影響苯妥英血藥濃度。通過這些結果,可以得出結論,苯妥英血漿濃度與臨床反應之間存在良好的相關性。因此,在對癲癇患者開處方苯妥英之前,必須定期監(jiān)測苯妥英和篩查HLA-A,B,C和DRB1基因型,以達到最大的臨床反應并預防嚴重的毒性。丙戊酸背景:丙戊酸的給藥劑量與血濃度間存在不可預測性和不利的相關性,顯示有必要對其血漿濃度進行常規(guī)檢測。目的:本研究是對丙戊酸的藥物監(jiān)測和丙戊酸治療監(jiān)測結果的對比評估,以評估中國癲癇患者不同年齡和性別組的臨床反應,依從性,安全性和毒性。方法:采用酶放大免疫測定法檢測206例(126例男性和80例女性)齊魯醫(yī)院神經內科接受丙戊酸治療的癲癇患者丙戊酸血濃度。對不同年齡組和性別組癲癇患者丙戊酸血濃度監(jiān)測結果進行匯總分析,比較評價患者依從性和丙戊酸安全性和毒性。將患者按男性和女性分組,然后將每個性別組進一步按年齡分為嬰兒、兒童、成人和老年人組。對兩個性別組的所有年齡組進行治療范圍、亞治療范圍和毒性范圍的評估。結果:總樣本中29%的樣本處于亞治療水平,13%的樣本處于毒性水平,58%的樣本丙戊酸水平處于治療范圍內。與男性樣本相比,女性樣本處于亞治療水平的數量更多,而在毒性范圍內的男性和女性數量相同。在男性患者中,與嬰兒、成年和老年男性組相比,男性兒童組在亞治療水平上具有更多的樣本數量。在女性患者中,與兒童、成人和老年女性組相比,女性嬰兒組在亞治療水平上具有更多的樣本數量。結論:本研究結果顯示血漿濃度與臨床反應之間的相關性很差。盡管治療范圍內的大部分樣品存在不利的臨床反應。女性患者,男性兒童患者和女性嬰兒患者在亞治療范圍內的樣本數量增加可能是由于依從性差或不合適的劑量導致不利的臨床反應。性別組:女性和高齡患者組:兒童(男性)和嬰兒(女性)可能需要更高的劑量才能達到最大的臨床反應。但仍需進一步的評估。通過這些結果可得出結論,丙戊酸血漿濃度與臨床反應之間相關性較差。第四部分:抗癲癇藥物對癲癇患者體內維生素水平的影響背景:有研究報道顯示,用抗癲癇藥治療可改變癲癇患者的維生素水平,且這可能介導抗癲癇藥的不良作用。另一方面,許多研究表明維生素水平不受抗癲癇藥物的影響。由于關于抗癲癇藥物對血清維生素水平的影響沒有明確的結論,需要進一步的臨床研究以確定新型的和常規(guī)的抗癲癇藥對癲癇患者血清維生素水平的影響,從而實現(xiàn)維生素補充劑的合理應用。許多報道指出,一些維生素的抗驚厥作用。正常維生素水平的變化可能嚴重影響整體健康狀況。目的:本研究旨在證實長期接受抗癲癇藥物治療的癲癇患者維生素水平是否發(fā)生變化,變化是否與抗癲癇藥的長期應用相關,何種維生素的水平受影響最大,以及維生素水平是否受性別和所使用的抗癲癇藥的種類與數量有關。方法:本研究在山東大學齊魯醫(yī)院神經內科合作下進行展開�？偣�63份接受抗癲癇藥單藥或多藥療法治療的癲癇患者的血清樣本,同時,采用電化學分析方法,測定九種維生素血清水平。采用SPSS技術對癲癇患者血清中九種維生素(B1,B2,B6,B9,B12,A,C,D和E)的結果進行了分析和評估。所有維生素的分析是在我們的實驗室使用相同的電化學分析進行的。結果:令人震驚的是,本研究中幾乎所有(90%)癲癇患者的血清維生素D水平都非常低。值得注意的是,72%和46%癲癇患者維生素C和維生素B1也分別低于的參考范圍。大多數患者的剩余維生素幾乎都在參考范圍內。在我們的研究中,維生素D,C和B1水平的平均值和頻率在不同性別組之間變化不大。與接受傳統(tǒng)抗癲癇藥物的患者相比,接受新型抗癲癇藥物的患者血清維生素D水平略有增加。我們發(fā)現(xiàn)單一治療患者的維生素D,C和B1血清水平低于多療法患者。結論:這項研究的最顯著和令人驚訝的發(fā)現(xiàn)表明,幾乎所有患者的血清維生素D水平都非常低,在一些患者中,維生素B1血清水平也低于參考范圍。更重要的是,這里首次報道,大多數這些中國癲癇患者的維生素C血清水平也低于參考范圍。建議除了抗癲癇藥物的治療藥物監(jiān)測外,還應定期監(jiān)測所有這些維生素。還建議這些維生素血清水平低的癲癇患者可以使用維生素補充劑和抗癲癇藥物,以更有效地控制其癲癇發(fā)作。更多的研究需要進一步的臨床試驗。全文結論本文對所建立癲癇患者體內5種抗癲癇藥物血濃度和維生素水平的色譜檢測方法與當前應用的檢測方法進行了比較。本研究數據、結果、結論對臨床醫(yī)生改善癲癇患者致死性預后和有效控制癲癇癥狀具有重要意義。1.抗癲癇藥物新方法的開發(fā)與驗證1.1本研究建立并驗證了兩種簡單、快捷、準確、靈敏度高、成本低的LC/MS方法,并用于卡馬西平、苯妥英、拉莫三嗪和左乙拉西坦人體血漿濃度的測定。該方法提取步驟簡單,血漿用量少,分析時間短,最低定量限低。1.2所建立方法成功用于癲癇患者相關治療藥物的監(jiān)測(TDM),也可用于相關藥物的生物等效性研究、毒代動力學研究和藥代動力學研究。1.3本研究所建立方法具有以下優(yōu)點,● 簡單,快速,精確,高度靈敏,需血漿量更少的;● 適用于低濃度相關藥物的定量分析;● 樣品前處理簡單,成本低,較少分析錯誤風險,比文獻液-液萃取和固相萃取程序更快,更經濟,更少污染物,有更好的回收率�！� 單樣本分析時間較文獻中描述方法短;● 定量范圍比文獻方法更廣泛;● 所建立方法的特異性,回收率,線性,穩(wěn)定性和準確度以及精確度結果均在ICH原則的范圍內。2傳統(tǒng)酶倍增免疫分析技術(EMIT)與本研究所建立的LC/MS方法卡馬西平和苯妥英血濃度相關性2.1 LC/MS和EMIT檢測方法所測卡馬西平和苯妥英血濃度數據,兩方法間有良好相關性(R2分別為0.971,0.921);2.2但LC/MS方法更適于大樣本檢測,而EMIT更迅速,更適于常規(guī)檢測。3.中國癲癇患者不同年齡和性別的臨床反應,依從性,安全性和毒性3.1本研究顯示,大部分接受苯妥英治療患者以及接近一半接受卡馬西平和丙戊酸治療患者,血濃度超出有效治療范圍,從而產生無效治療和不良反應;3.2卡馬西平、苯妥英鈉和丙戊酸血濃度存在差異,與性別和年齡有關,與依從性差、不足或過量用藥有關;3.3卡馬西平和苯妥英臨床反應與血濃度呈正相關,但丙戊酸臨床反應與血濃度呈負相關,具體機制尚需進一步研究證實。4.抗癲癇藥物對癲癇患者維生素水平的影響4.1中國癲癇患者維生素D水平顯著低于正常人群,維生素C和維生素B1也低于參考范圍:4.2維生素D 水平因年齡、抗癲癇藥物種類不同而異,與是否聯(lián)合用藥有關,但與性別無關;4.3維生素鑒于中國建議定期監(jiān)測癲癇患者維生素水平,并根據檢測數據,作為神經保護劑補充應用,避免維生素缺乏癥,提高癲癇治療的有效性,但須進一步的臨床試驗和調查。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R969


本文編號：2751506