【摘要】：研究背景光致敏屬于嚴(yán)重的皮膚毒性作用,是化合物在光照條件下所引起的一種特殊皮膚過敏反應(yīng)。臨床表現(xiàn)為皮膚曝光部位出現(xiàn)紅斑、丘疹、水皰等改變,伴有瘙癢或灼痛感,嚴(yán)重者會引起全身癥狀。光致敏性評價(jià)是皮膚用藥、某些系統(tǒng)給藥藥物和化妝品安全評價(jià)中的重要項(xiàng)目,FDA、ICH和NMPA的相關(guān)指導(dǎo)原則中都要求對具有潛在光致敏作用的化合物進(jìn)行評價(jià)。目前國內(nèi)外公認(rèn)的光致敏評價(jià)方法只有豚鼠光致敏試驗(yàn),但該方法應(yīng)用動物數(shù)較多,試驗(yàn)周期長,對動物造成的損傷較大,不符合動物福利原則,并且該方法缺乏客觀定量的評價(jià)指標(biāo)。另外,多個(gè)國家和地區(qū)已經(jīng)全面禁止化妝品動物試驗(yàn),并禁止新近做過動物試驗(yàn)的化妝品上市銷售。因此亟需開發(fā)化合物光致敏體外評價(jià)方法。研究目的本研究的目的是完善已建立的THP-1細(xì)胞光致敏體外評價(jià)方法,確定光致敏具體評價(jià)指標(biāo)和判定標(biāo)準(zhǔn),并對建立的方法進(jìn)行準(zhǔn)確性、特異性、靈敏度和重復(fù)性的驗(yàn)證。研究方法1、以細(xì)胞表面標(biāo)志物為評價(jià)指標(biāo)的光致敏體外評價(jià)方法的驗(yàn)證將THP-1細(xì)胞分別與19種光致敏劑、4種光刺激劑、2種皮膚致敏劑、1種皮膚刺激劑及1種陰性受試物在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h,每種受試物3-4個(gè)孵育濃度(皮膚刺激劑和陰性化合物為一個(gè)濃度),之后進(jìn)行UVA照射或避光處理,照射強(qiáng)度為1.7 mw/cm2,照射或避光處理時(shí)間為50 min。UVA照射后將細(xì)胞換液,加入細(xì)胞培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后用流式細(xì)胞儀測定THP-1細(xì)胞表面生物標(biāo)志物CD54和CD86的表達(dá)水平。用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色測定活細(xì)胞百分比,在保證細(xì)胞活率大于75%的基礎(chǔ)上進(jìn)行CD54和CD86檢測。檢測照射組和未照射組表達(dá)CD54、CD86的陽性細(xì)胞百分比及平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI),并計(jì)算CD54和CD86的相對熒光強(qiáng)度(relative fluorescence intensity,RFI)。(1)在未照射條件下:RFI= 受試物非照射組“抗CD54或CD86抗體”MFI-本組同型對照MFI/細(xì)胞對照非照射組“抗CD54或CD86抗體”MFI-本組同型對照MFI(2)在照射條件下:RFI=(受試物照射組“抗CD54或CD86抗體”MFI-本組同型對照MFI)/(細(xì)胞對照照射組“抗CD54或CD86抗體”MFI-本組同型對照MFI)對于具有光刺激性的4種受試物及部分光致敏劑額外增加預(yù)照射處理試驗(yàn)組,即先將受試物加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)(無細(xì)胞),UVA照射30 min,避光放置15 min,再與THP-1細(xì)胞共同孵育,之后進(jìn)行后續(xù)的與其它受試物相同的試驗(yàn)操作,并檢測CD54和CD86的表達(dá)水平。確定以細(xì)胞表面標(biāo)志物為評價(jià)指標(biāo)的THP-1細(xì)胞光致敏體外評價(jià)方法的具體評價(jià)指標(biāo)和陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),并對建立的方法進(jìn)行準(zhǔn)確性、特異性、靈敏度和重復(fù)性的驗(yàn)證。2、以細(xì)胞因子為評價(jià)指標(biāo)的光致敏體外評價(jià)方法的驗(yàn)證本部分方法中所用受試物與第一部分相同。將THP-1細(xì)胞與上述多種不同類型的受試物分別孵育24h,每種受試物3-4個(gè)孵育濃度(皮膚刺激劑和陰性化合物為一個(gè)濃度),之后進(jìn)行UVA照射,照射強(qiáng)度為1.7 mw/cm2,照射或避光處理時(shí)間為50 min在照射結(jié)束后5 h用Luminex技術(shù)檢測各個(gè)受試物照射組和非照射組THP-1細(xì)胞上清液和裂解液中IL-8和TNF-α的含量,并計(jì)算照射組/非照射組IL-8含量的比值和照射組/非照射組TNF-α含量的比值。對于具有光刺激性的4種受試物及部分光致敏劑額外增加預(yù)照射處理試驗(yàn)組,即先將受試物加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)(無細(xì)胞),UVA照射30 min,避光放置15 min,再與THP-1細(xì)胞共同孵育,之后進(jìn)行后續(xù)的與其它受試物相同的試驗(yàn)操作,并檢測IL-8和TNF-α的含量。確定以細(xì)胞因子為評價(jià)指標(biāo)的THP-1細(xì)胞光致敏體外評價(jià)方法的具體評價(jià)指標(biāo)和陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),并對建立的方法進(jìn)行準(zhǔn)確性、特異性、靈敏度和重復(fù)性的驗(yàn)證。研究結(jié)果1、以細(xì)胞表面標(biāo)志物為評價(jià)指標(biāo)的光致敏體外評價(jià)方法的驗(yàn)證THP-1細(xì)胞分別與多種不同濃度的光致敏劑孵育并經(jīng)UVA照射后,19種光致敏劑中有15種引起照射組THP-1細(xì)胞表達(dá)CD54的MFI較非照射組顯著性增加,,且照射組CD54的RFI值均在1.5以上。4種光刺激劑與THP-1細(xì)胞孵育以及UVA照射后也可引起細(xì)胞表達(dá)CD54的MFI顯著性增加,但經(jīng)過預(yù)照射處理后,預(yù)照射組CD54的表達(dá)比直接照射組(未經(jīng)預(yù)照射)顯著下降,預(yù)照射處理可以對光刺激劑和光致敏劑進(jìn)行鑒別。本研究中所有光致敏劑和光刺激劑均未引起THP-1細(xì)胞光照前后CD86表達(dá)的明顯變化。皮膚致敏劑DNCB和CHD在未經(jīng)UVA照射時(shí)即可引起THP-1細(xì)胞表達(dá)CD54的MFI顯著性增加,在照射后CD54 MFI沒有進(jìn)一步增加,反而比照射前略有下降。非照射和照射條件下,皮膚致敏劑均可引起THP-1細(xì)胞表達(dá)CD86比細(xì)胞對照組顯著性增加。皮膚致敏劑引起CD54和CD86表達(dá)變化的特點(diǎn)與光致敏劑明顯不同。皮膚刺激劑和陰性受試物均未引起照射組THP-1細(xì)胞表達(dá)CD54和CD86的顯著性變化,其照射組CD54的RFI值均小于1.5�；谝陨辖Y(jié)果,確定與受試物孵育并經(jīng)紫外照射后THP-1細(xì)胞表達(dá)CD54的MFI和RFI為以細(xì)胞表面標(biāo)志物為評價(jià)指標(biāo)的光致敏體外評價(jià)方法的具體評價(jià)指標(biāo)。初步確定了該方法中受試物光致敏陽性的判定標(biāo)準(zhǔn):①紫外照射后THP-1細(xì)胞表達(dá)CD54的MFI 比照射前顯著性增加;②紫外照射后THP-1細(xì)胞表達(dá)CD54的RFI≥1.5。③當(dāng)上述兩條均滿足時(shí),應(yīng)對受試物進(jìn)行預(yù)照射處理,預(yù)處理照射組CD54 RFI≥1.5并且與直接照射組(未經(jīng)預(yù)照射)CD54的RFI相比無顯著性差異。同時(shí)滿足這三個(gè)條件則可判定受試物為光致敏陽性。對該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果顯示其評價(jià)化合物光致敏性的準(zhǔn)確度為85.2%,特異性為100%,靈敏度為78.9%,重復(fù)性較好。2、以細(xì)胞因子為評價(jià)指標(biāo)的光致敏體外評價(jià)方法的驗(yàn)證THP-1細(xì)胞分別與多種不同濃度的光致敏劑孵育并經(jīng)UVA照射后,19種光致敏劑中有13種引起照射組THP-1細(xì)胞分泌IL-8比非照射組顯著性增加,且照射組/非照射組IL-8含量比值均在6.5以上。有8種光致敏劑引起照射組THP-1細(xì)胞分泌TNF-α顯著性增加,但增加的幅度明顯小于IL-8增加的幅度。光刺激劑與THP-1細(xì)胞孵育以及UVA照射后也可引起細(xì)胞分泌IL-8顯著性增加,但經(jīng)過預(yù)照射處理后,預(yù)照射組IL-8含量比直接照射組(未經(jīng)預(yù)照射)顯著下降,且預(yù)處理照射組/非照射組IL-8含量比值小于6.5。皮膚致敏劑在未經(jīng)UVA照射時(shí)即可引起THP-1細(xì)胞分泌IL-8顯著性增加,在照射后也會引起THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-8比非照射組顯著性增加,照射組/非照射組IL-8含量比值小于6.5。照射條件下,皮膚刺激劑SLS和陰性受試物乳酸也引起THP-1細(xì)胞分泌IL-8顯著性增加,但照射組/非照射組IL-8含量比值均小于6.5。本研究中的光刺激劑、皮膚致敏劑、皮膚刺激劑、陰性受試物均未引起THP-1細(xì)胞光照后TNF-α含量的顯著性變化�；谝陨辖Y(jié)果,確定與受試物孵育并經(jīng)紫外照射后THP-1細(xì)胞中IL-8含量以及照射組/非照射組IL-8的含量比值作為以細(xì)胞因子為評價(jià)指標(biāo)的光致敏體外評價(jià)方法的具體評價(jià)指標(biāo),并初步確定了該方法中受試物光致敏陽性的判定標(biāo)準(zhǔn):①UVA照射后THP-1細(xì)胞中IL-8含量比非照射組顯著性增加;②UVA照射組IL-8含量/非照射組IL-8含量比值多6.5;③當(dāng)上述兩條均滿足時(shí),對受試物進(jìn)行UVA預(yù)照射處理,預(yù)處理照射組IL-8的含量與直接照射組(未經(jīng)預(yù)照射)相比無顯著性差異,且預(yù)處理照射組IL-8含量/預(yù)處理非照射組IL-8含量比值≥6.5。同時(shí)滿足以上條件則可判定受試物為光致敏陽性。對該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果顯示其評價(jià)化合物光致敏性的準(zhǔn)確度為77.8%,特異性為100%,靈敏度為68.4%,重復(fù)性較好。研究結(jié)論本研究分別建立了以CD54和IL-8為評價(jià)指標(biāo)的兩種THP-1細(xì)胞光致敏體外評價(jià)方法,確定了受試物光致敏陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)驗(yàn)證,兩種光致敏體外評價(jià)方法具有較好的準(zhǔn)確度、特異性、靈敏度和重復(fù)性。
【學(xué)位授予單位】：中國食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96;TQ658
【圖文】：

中國食品藥品檢定研究院碩士畢業(yè)論文(5) 芬替克洛引起光照前后 THP-1 細(xì)胞 CD54、CD86 的表達(dá)如圖 1-5、表 1-4 所示，當(dāng)芬替克洛濃度分別為 5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL時(shí)，芬替克洛照射組與非照射組相比，表達(dá) CD54 陽性細(xì)胞百分比未有顯著性差異；平均熒光強(qiáng)度 MFI 顯著性增加（P≤0.01），增加的百分比約為 9%-32%；受試物照射組與細(xì)胞對照照射組相比，表達(dá) CD54 陽性細(xì)胞百分比和 CD54 的 MFI也顯著性增加（P≤0.01）。受試物組與細(xì)胞對照組相比，THP-1 細(xì)胞表達(dá) CD86無顯著性變化；受試物照射組與非照射組相比，THP-1 細(xì)胞表達(dá) CD86 也無顯著性變化。

圖 1-6 不同濃度下葵子麝香引起細(xì)胞表達(dá) CD54 和 CD86 的平均熒光強(qiáng)度UVA- ：非照射組；UVA+ ：照射組；照射組與非照射組相比，#P<0.05，##P<0.01;受試物組與細(xì)胞對照組相比，*P<0.05，**P<0.01(7) 磺胺引起光照前后 THP-1 細(xì)胞 CD54、CD86 的表達(dá)如圖 1-7、表 1-4 所示，當(dāng)磺胺濃度分別為 1500 μg/mL、2000 μg/mL、2500μg/mL 時(shí)，氯丙嗪照射組與非照射組相比，表達(dá) CD54 陽性細(xì)胞百分比未有顯著性差異；平均熒光強(qiáng)度 MFI 顯著性增加（P≤0.01），增加的百分比約為 30%-47%；受試物照射組與細(xì)胞對照照射組相比，表達(dá) CD54 陽性細(xì)胞百分比和 CD54 的MFI 顯著性增加（P≤0.01）。受試物組與細(xì)胞對照組相比，THP-1 細(xì)胞表達(dá) CD86無顯著性變化；受試物照射組與非照射組相比，THP-1 細(xì)胞表達(dá) CD86 也無顯著性變化。

圖 1-7 不同濃度下磺胺引起細(xì)胞表達(dá) CD54 和 CD86 的平均熒光強(qiáng)度UVA- ：非照射組；UVA+ ：照射組； 照射組與非照射組相比，#P<0.05，##P<0.01;受試物組與細(xì)胞對照組相比，*P<0.05，**P<0.01(8) 硫氯酚引起光照前后 THP-1 細(xì)胞 CD54、CD86 的表達(dá)如圖 1-8、表 1-4 所示，當(dāng)硫氯酚濃度分別為 30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL 時(shí)，硫氯酚照射組與非照射組相比，表達(dá) CD54 陽性細(xì)胞百分比未有顯著性差異；平均熒光強(qiáng)度 MFI 顯著性增加（P≤0.01），增加的百分比約為25%-50%；受試物照射組與細(xì)胞對照照射組相比，表達(dá) CD54 陽性細(xì)胞百分比未增加，CD54 的 MFI 顯著性增加（P≤0.01）。受試物組與細(xì)胞對照組相比，THP-1細(xì)胞表達(dá) CD86 無顯著性變化；受試物照射組與非照射組相比，THP-1 細(xì)胞表達(dá)CD86 也無顯著性變化。

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本文編號：2749599