【摘要】：研究背景近年來,氧化石墨稀(Graphene oxide,GO)在生物醫(yī)學領域被廣泛應用于腫瘤靶向治療、細胞成像、組織工程及抗菌、殺菌等方面。應用范圍的擴大同時導致GO對人體的暴露風險劇增。越來越多的研究報道納米材料能夠穿透血腦屏障或經(jīng)神經(jīng)攝取進入腦組織,產(chǎn)生潛在危害,因此評估GO對神經(jīng)系統(tǒng)的生物安全性至關重要。納米材料被發(fā)現(xiàn)是一種新型的自噬激活劑。生理狀態(tài)下自噬有利于細胞內穩(wěn)態(tài)的維持,當自噬啟動異常,或者出現(xiàn)功能障礙時,會對細胞產(chǎn)生有害影響,甚至引發(fā)細胞程序性死亡。本研究采用慢病毒及干擾RNA轉染技術、免疫熒光染色、流式細胞術及WB等檢測手段,深入探討GO對PC12神經(jīng)細胞的毒性變現(xiàn)及作用機制。研究目的1.探討自噬效應在GO神經(jīng)毒表現(xiàn)中的重要作用。2.探討溶酶體功能障礙和自噬流紊亂之間的關聯(lián)。3.探討自噬底物p62過度積累和細胞凋亡的相互關系。材料與方法1.材料表征掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡檢測GO的初始粒徑,紅外光譜和拉曼光譜檢測分子結構,X射線光電子能譜檢測化學鍵和元素含量,動態(tài)光散射儀檢測粒徑分布和電位值。2.GO對細胞的增殖毒性及胞內攝取情況的研究:將細胞和GO共培養(yǎng),采用細胞增殖毒性試劑盒及乳酸脫氫酶試劑盒測試細胞活力。細胞黏附及攝取研究:將FITC-BSA和GO等體積混合,孵育過夜,制備熒光標記GO。將細胞和熒光標記GO共培養(yǎng),鬼筆環(huán)肽和DAPI染色,顯微鏡及流式檢測熒光強度。此外,正常GO處理細胞24 h,戊二醛固定,SEM觀察GO黏附情況。3.GO誘導自噬效應及相關信號通路的研究將細胞和GO共培養(yǎng)24 h后戊二醛固定,TEM觀察自噬體。將慢病毒轉染細胞和GO共培養(yǎng),設置雷帕霉素陽性對照,觀察自噬熒光點。將正常細胞和GO共培養(yǎng),設置740-YP、SC79和3BDO激動劑處理組,Western blot(WB)檢測自噬蛋白及相關信號通路的表達水平。4.GO損害溶酶體功能誘導自噬流阻滯將細胞和GO共培養(yǎng),溶酶體示蹤劑孵育,顯微鏡和流式細胞儀檢測熒光強度。此外,用按照說明書檢測酸性磷酸酶及組織蛋白酶B的活力值。最后,采用抗galectin-3和抗LAMP-1抗體孵育細胞,顯微鏡觀察。5.p62蛋白積累導致細胞凋亡及相關信號通路的研究凋亡觀察:將細胞和GO共孵育24 h,采用Annexin V-FITC/PI及LDH試劑盒測試。此外,設置CCCP 陽性對照,Hoechst染色后觀察細胞核。最后采用WB檢測凋亡相關蛋白的表達水平。p62蛋白回復檢測:雷帕霉素和GO共處理細胞,采用LDH及Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測凋亡發(fā)生,WB檢測凋亡相關蛋白的表達。siRNA-p62轉染細胞后和GO共培養(yǎng),WB檢測凋亡蛋白的表達。統(tǒng)計分析采用Graphpad Prism(Graphpad,CA,USA)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,測定結果以x±s表示。不同組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)或獨立樣本t檢驗(Student's t test)。假設檢驗為雙側檢驗,檢驗水準a=0.05。結果1.GO呈薄片層狀,厚度在1.0 nm左右。其特征性波峰為Dband和Gband,功能化學鍵包括C-O鍵、C=O鍵、C=C鍵及O-C=O鍵。GO在水溶液中,粒徑分布在797.42 nm左右,Zeta電位是-47.9± 0.79 mV。在細胞培養(yǎng)基中,粒徑為439.14±17.25 nm,Zeta電位是-9.82±1.06 mV。2.隨著孵育時間的延長和材料濃度增加,GO對細胞的毒性作用逐漸增大。3.細胞對GO的攝取隨時間延長而增加。GO進入細胞后,胞漿中出現(xiàn)大量自噬體。慢病毒轉染細胞后,胞漿內出現(xiàn)大量的自噬熒光點。與陽性組相比,實驗組自噬熒光點的紅、綠色熒光比值明顯下降。WB發(fā)現(xiàn)Atg5、p62及LC3 Ⅱ/Ⅰ均明顯上升。通路蛋白PI3K、p-Akt和p-mTOR表達明顯下降。4.隨著GO濃度增大,溶酶體腔的pH值上升。同時,組織蛋白酶B和酸性磷酸酶的活力明顯下降。溶酶體膜通透性也明顯增加。5.Annexin-FITC/PI雙染色發(fā)現(xiàn),GO引起細胞凋亡。同樣,JC-1檢測發(fā)現(xiàn)細胞內紅、綠熒光比值明顯下降。此外,細胞核形態(tài)不規(guī)則,染色質深染。WB發(fā)現(xiàn)促凋亡蛋白表達上調,抗凋亡蛋白表達下調。雷帕霉素共處理后,細胞活力恢復,細胞凋亡率下降。此外,WB觀察到自噬蛋白p62下調,促凋亡蛋白表達下調,而抗凋亡蛋白表達上調。采用siRNA敲低細胞內p62表達水平,出現(xiàn)類似效果。結論1.GO和PC12細胞共培養(yǎng)會產(chǎn)生濃度依賴性和時間依賴性的毒理作用。2.GO通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路激活自噬上游。同時,干擾溶酶體酸性pH值和正常膜通透性,導致溶酶體降解功能下降,引起自噬流下游紊亂,出現(xiàn)自噬底物p62蛋白的異常積累。3.p62蛋白上調會導致細胞凋亡,采用化學試劑或基因干擾降低p62的表達能夠緩解凋亡發(fā)生。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R99

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本文編號：2749586