【摘要】：干擾素(interferon,IFN)是一種具有廣譜抗腫瘤、抗病毒活性和免疫增強(qiáng)功能的糖蛋白類細(xì)胞因子,是目前臨床上最主要的抗腫瘤生物制品之一。重組人干擾素ɑ-2b(Recombinant human interferonɑ-2b,rhIFNɑ-2b)與天然人IFNɑ-2b具有相同的生物學(xué)活性,可與其他藥物聯(lián)用持續(xù)治療小細(xì)胞或非小細(xì)胞肺癌。與多數(shù)蛋白大分子藥物一樣,rh IFNɑ-2b在體內(nèi)半衰期短,藥理活性不專一,且制劑的制備條件和釋放環(huán)境顯著影響其穩(wěn)定性,使其廣泛應(yīng)用受限。本文基于離子交換和靜電自組裝技術(shù),制備了高包封率、并負(fù)載高活性rhIFNɑ-2b的殼聚糖-羧甲基殼聚糖微球(CS-rh IFNɑ-2b-CMCS-MS),微球具有緩釋效果,并被動(dòng)靶向至肺。該藥物傳遞系統(tǒng)可廣泛應(yīng)用于蛋白多肽類藥物。全文共分為以下五部分:一、綜述本章首先簡(jiǎn)要綜述了蛋白大分子模型藥物-干擾素的理化性質(zhì)、抗肺癌活性及制劑開發(fā)方向;其次,概述了目前蛋白多肽類藥物可生物降解微球的常用載體、制備方法以及應(yīng)用過(guò)程普遍存在的問(wèn)題;最后,綜述了羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl Chitosan,CMCS)離子交換基質(zhì)在生物大分子傳遞系統(tǒng)中的應(yīng)用和機(jī)理。二、空白羧甲基殼聚糖多孔微球的制備及表征本章采用乳化交聯(lián)法制備空白羧甲基殼聚糖多孔微球(CMCS-MS),以微球的形貌粒徑、孔隙率為指標(biāo),分別篩選CMCS溶液的濃度、水油相比例、乳化劑用量、致孔劑用量、交聯(lián)劑用量、乳化攪拌速度等影響因素,優(yōu)化處方工藝。最終確定微球制備工藝為:2%CMCS、水油相比1:8、吐溫-80用量為水相體積的2%、司盤80用量為油相體積的2%、乙酸乙酯與水相體積比2:5、交聯(lián)劑與水相質(zhì)量比1:5、乳化攪拌速度900 rpm、乳化1h、固化3 h,反應(yīng)結(jié)束后正己烷、無(wú)水乙醇、去離子水充分洗滌,凍干即得淺黃色粉狀微球。掃描電鏡(SEM)表征微球的形貌,空白微球外觀圓整,多孔隙,最大孔徑200~300 nm。75%以上微球粒徑分布在5~15μm,易被肺部毛細(xì)血管截留。傅里葉紅外光譜(FTIR)證明交聯(lián)微球的形成。微球孔隙率(30.28±1.14)%、離子交換容量(9.97±0.07)mmol/g,且在各溶液中均呈負(fù)電位,證明其具有較好的吸引和容納正電荷藥物的能力。此外,用電位滴定曲線闡明了微球上可交換基團(tuán)(羧基)的解離行為,確定微球的離子交換最佳pH為4.3以上。微球具有pH和離子響應(yīng)性,在pH7.4人體液模擬環(huán)境和0.9%生理鹽水中溶脹明顯快于pH1.2胃液模擬環(huán)境。微球體外降解能力、熱穩(wěn)定性良好。MTT試驗(yàn)評(píng)價(jià)空白微球細(xì)胞毒性,微球生物相容性良好。三、載牛血清白蛋白-羧甲基殼聚糖微球的制備本章建立了微球包封率及載藥量、體外釋放測(cè)定方法,采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白藥物含量,并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。采用離子交換動(dòng)態(tài)載藥法,以牛血清白蛋白(Bovine albumin,BSA)為大分子模型藥物,載藥量為評(píng)價(jià)指標(biāo),固定離子交換柱穿透率為0.1,單因素試驗(yàn)篩選出合適的緩沖液種類、溶液pH、離子強(qiáng)度、藥物濃度、反應(yīng)溫度、柱子橫截面積、溶液流速等,制得高活性和高包封率的載牛血清白蛋白-羧甲基殼聚糖微球(BSA-CMCS-MS),為后面微球荷載rhIFNα-2b奠定基礎(chǔ)。最終確定制備工藝為:動(dòng)態(tài)玻璃交換柱(Ф16 mm×20cm),柱高徑比7:1,室溫25±0.5℃,5 mg/mL BSA溶液(0.02 mol/L pH4.6 HAc-NaAc),流速0.2 m L·min~(-1),12.5分鐘時(shí)停止載藥,用少量去離子水洗去微球表面未結(jié)合藥物,待溶液流盡后,將微球取出凍干即可。在濕態(tài)微球表面自組裝一層殼聚糖(Chitosan,CS)膜得自組裝微囊(CS-BSA-CMCS-MS),微球包封率(84.39±6.19)%,初始釋放進(jìn)一步減小。差示掃描量熱譜圖(DSC)和微球體外釋藥結(jié)果驗(yàn)證BSA與微球主要以離子鍵結(jié)合。自組裝后微球釋藥機(jī)制由離子交換釋放(粒擴(kuò)散)轉(zhuǎn)變?yōu)橐患?jí)釋放(膜擴(kuò)散),體外24小時(shí)累計(jì)釋放86.78%。圓二色光譜(CD)和SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)和純度在載/釋藥前后無(wú)明顯變化。四、載干擾素-羧甲基殼聚糖微球的制備采用第四章動(dòng)態(tài)載藥處方工藝優(yōu)化得出的工藝參數(shù),以動(dòng)態(tài)法制備rhIFNɑ-2b離子交換微球,并固定離子交換柱穿透率為0.1,考察溶液pH對(duì)載藥量的影響。進(jìn)一步自組裝制備符合微囊(CS-rh IFNα-2b-CMCS-MS),微球包封率(89.91±0.38)%,體外24小時(shí)累計(jì)釋放度83.89%,且無(wú)突釋。CD和SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,rhIFNα-2b的二級(jí)結(jié)構(gòu)和純度在載/釋藥前后無(wú)明顯變化。細(xì)胞水平上的抗肺癌生物學(xué)活性研究表明,相同濃度的載藥微球釋放液保留了原液對(duì)A549細(xì)胞91.98%以上的抗增殖活性,初步證明該方法較好地保持了rhIFNα-2b在制備和釋放過(guò)程中的生物學(xué)活性。五、小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及組織分布研究本章建立了雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定小鼠血漿及組織rhIFNα-2b濃度,并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明,尾靜脈注射rhIFNα-2b原液和微球混懸液后,微球組較原液組有明顯的緩釋作用,微球達(dá)峰時(shí)間延后至1.5 h,半衰期9.039 h,平均滯留時(shí)間11.997 h,顯著長(zhǎng)于原液組。組織分布試驗(yàn)證明,載藥微球能濃集于肺部,提高肺部rhIFNα-2b峰濃度(為溶液組的1.85倍),相比原液具有顯著肺靶向效果。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R943
【圖文】：

圖 1.2 羧甲基殼聚糖多孔微球制備工藝流程圖. 2 Preparation process of carboxymethyl chitosan porous micro聚糖離子交換基質(zhì)的研究進(jìn)展聚糖概述（carboxymethylchitosans,CMCS）是殼聚糖的羧甲基同，可以分為 O-羧甲基殼聚糖（O-CMCS），N-羧甲基（NO-CMCS），N,N-羧甲基殼聚糖（NN-CMCS）[46水溶性、生物相容性、可生物降解、低毒、可緩釋、。近年來(lái)，CMCS 被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥[47-49]、組織保健品等多種領(lǐng)域。特別是其作為各種生物活性物傳遞系統(tǒng)領(lǐng)域的應(yīng)用得到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注。

圖 1.4 羧甲基殼聚糖離子交換微球載藥和釋藥機(jī)理re1.4 Mechanism of drug loading and release of CMCS-MS ion exchange m性條件下，環(huán)境 pH 小于 rhIFNα-2b 等電點(diǎn)，rhIFNα-2b 帶正電聚糖微球離子結(jié)合。采用動(dòng)態(tài)載藥法，當(dāng)流出液檢測(cè)到藥物時(shí)率理論可達(dá) 100%。而在人體生理環(huán)境下，體內(nèi)的正離子（如α-2b 置換釋放出來(lái)，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用。據(jù)類藥物因其高活性、高特異性、低毒性、生物功能明確等優(yōu)勢(shì)來(lái)源。但很多因素顯著影響蛋白藥物穩(wěn)定性。利用殼聚糖及其術(shù)制備蛋白多肽類藥物可生物降解緩釋微球一直是藥學(xué)領(lǐng)域研研究意義在于：首先，羧甲基殼聚糖是一種具有一定緩釋效果

殼聚糖及其衍生物微球的制備方法很多，但為盡可能保留微球上的羧基，進(jìn)行后續(xù)的藥物離子交換載藥，本試驗(yàn)需避免選擇損失大量羧基結(jié)合位點(diǎn)的制備方法，因此較合適的固化方法是氨醛反應(yīng)，交聯(lián)后微球上氨基含量大量減少，從而使得羧基能夠更好的發(fā)揮其離子交換正電荷藥物的能力。該法產(chǎn)率高、制得的微球穩(wěn)定性好，為后期動(dòng)態(tài)載藥影響因素考察提供了充足的質(zhì)量合格的微球儲(chǔ)備。本課題使用少量低濃度戊二醛為交聯(lián)劑，乳化交聯(lián)法進(jìn)行空白微球的制備。致孔原理：將乙酸乙酯加入到含有乳化劑的水相中，形成 O/W 型乳液。然后將該 O/W型乳液轉(zhuǎn)移入油相中，進(jìn)一步乳化形成 O/W/O 型三相乳液，交聯(lián)固化后形成微球。整個(gè)過(guò)程乙酸乙酯不參與反應(yīng)，收集微球時(shí)，用乙醇提取微球，去離子水洗，即可除去微球內(nèi)的致孔劑。微球內(nèi)部的水份在凍干過(guò)程中形成冰晶，不斷升華，從而形成微球內(nèi)部和表面的孔道。由此，制得了羧甲基殼聚糖多孔微球。2.3.1.2 羧甲基殼聚糖溶液濃度的影響

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王芹;張晟瑞;聶峰;;光譜法研究?jī)煞N抗菌類藥物對(duì)牛血清白蛋白結(jié)構(gòu)變化的影響[J];化學(xué)研究與應(yīng)用;2014年08期

2 葉漫文;曾曙光;高文峰;容明燈;郭澤鴻;石勇;干輝勇;;京尼平交聯(lián)的絲素蛋白-殼聚糖緩釋微球的制備與表征[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年06期

3 李慧玲;楊冬琴;曹欣;黃宏齡;丁苗;徐海能;劉新垣;李名揚(yáng);;超級(jí)干擾素抑制A549增殖誘導(dǎo)其衰老[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2011年05期

4 陳紅麗;呂潔麗;晏杰;王銀松;郭偉云;豐慧根;陳漢;張其清;;殼聚糖修飾的PLGA納米粒作為蛋白多肽類藥物載體的研究[J];功能材料;2011年02期

5 丁靜;陸春燕;陳鋼;牧磊;臧林泉;王來(lái)友;;雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定人干擾素α-2b在豚鼠體液中的含量[J];中國(guó)新藥雜志;2010年16期

6 李斌;鄭先創(chuàng);陳理兵;葛海雄;;殼聚糖多孔微球的制備與表征[J];南京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué));2010年02期

7 顧覺奮;;離子交換樹脂藥物載體在給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用[J];離子交換與吸附;2010年01期

8 黃嵐;辛劍宇;張楠;李建樹;;陽(yáng)離子β-環(huán)糊精聚合物復(fù)合胰島素的海藻酸鈉/殼聚糖載藥微球[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2009年08期

9 厲孟;劉旭東;劉興炎;;京尼平與戊二醛交聯(lián)明膠微球的性能比較[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2009年01期

10 王丹;;多肽及蛋白類藥物微球的載體材料、制備以及突釋現(xiàn)象[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2008年10期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 蔣艷博;基于蛋白質(zhì)—金屬配合物的干擾素緩釋傳遞系統(tǒng)的研究[D];沈陽(yáng)藥科大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前6條

1 趙鑫;重組人干擾素α-2b的新型制備方法及其長(zhǎng)效制劑研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 葉文婷;靜電噴法制備殼聚糖及其衍生物微球及其應(yīng)用研究[D];華南理工大學(xué);2014年

3 王學(xué)文;磁性高分子載藥微球的制備及性能研究[D];廣東藥學(xué)院;2012年

4 王振旺;乳化交聯(lián)法制備殼聚糖微球及其包載藥物的研究[D];天津大學(xué);2007年

5 王啟釗;殼聚糖及其衍生物微球的制備以及作為介入治療材料的基礎(chǔ)研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2006年

6 謝永美;N，O-羧甲基殼聚糖—阿霉素偶聯(lián)物的合成及其性質(zhì)研究[D];四川大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2748975