【摘要】：目的近些年,伴隨著快速的工業(yè)發(fā)展,大氣污染問題愈加嚴重,頻繁出現(xiàn)了霧霾天氣。空氣細顆粒物的濃度與霧霾天氣的出現(xiàn)有著緊密聯(lián)系,因而對空氣中PM2.5(Particulate Matter 2.5)等細顆粒物的研究成為熱點。本課題采集大氣中的以PM2.5直徑為主的細顆粒物,制備PM2.5氣霧化暴露Wistar大鼠模型及PM2.5混懸液處理人肺上皮細胞H1299、H292細胞模型,研究PM2.5對大鼠上呼吸道菌群組成改變及人肺上皮細胞因PM2.5引起周期阻滯的影響。通過使用單濃度口鼻暴露系統(tǒng)(HRH-MNE3026)進行染塵,高通量測序檢測Wistar大鼠染塵前后上呼吸道菌群差異,Western檢測肺組織、H1299、H292細胞的cyclinD1、TS、mTOR、P70S6K1表達水平。通過相應指標探討大氣污染物PM2.5影響上呼吸道菌群組成及誘導人肺上皮細胞周期阻滯的情況。方法1.收集PM2.5的纖維濾紙,按國家環(huán)境質量二級標準的10倍,制備一定濃度(750 μg/m3)的PM2.5混懸液暴露Wistar大鼠模型。2.應用16S rDNA檢測染塵前后不同時間段(2W、4W)大鼠口咽部菌群的變化情況。3.流式細胞儀檢測PM2.5處理前后兩種傳代細胞系(人肺上皮H292和H1299細胞)細胞周期的改變。4.Western檢測兩個細胞系及暴露2周、4周后大鼠肺組織中TS、cyclinD1、mTOR、P70S6K1蛋白的表達量。5.瞬時轉染:用TS的siRNA抑制劑轉染H292細胞,抑制TS分子的表達。6.統(tǒng)計學分析:第一部分16S rDNA高通量測序結果,使用R Studio軟件完成實驗結果的統(tǒng)計分析,呼吸道菌群的異同性采用聚類分析;P值計算基于Wilcoxon秩和檢驗,并經(jīng)過FDR校正(P0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。第二部分結果采用SPSS 22.0軟件進行結果分析,用方差分析確定統(tǒng)計學顯著性(P0.05),認為具有統(tǒng)計學意義。結果1.16S rDNA高通量測序結果顯示,隨著大鼠染塵時間的增加,呼吸道菌群組間豐度及多樣性有所改變,使得呼吸道菌群中優(yōu)勢菌減少,條件致病菌菌群豐度增加。2.PM2.5處理H292、H1299細胞48 h后,H292、H1299細胞的細胞周期阻滯在S期,cyclinD1的表達下調(P0.05)。當PM2.5濃度為200 μg/mL時,S期細胞百分比分別達到50.35%和56.20%。為了分析PM2.5誘導的肺損傷,采用暴露染塵Wistar大鼠實驗。結果發(fā)現(xiàn)與細胞暴露實驗一致,PM2.5暴露組中cyclinD1蛋白表達下調(P0.05)。3.隨著PM2.5處理H292和H1299細胞濃度的增加,TS蛋白表達下調(P0.05)。體內暴露Wistar大鼠后,暴露組肺組織TS蛋白表達也下調(P0.05)。4.H292細胞中抑制TS分子的表達,導致PM2.5暴露后細胞周期阻滯更明顯和cyclin D1蛋白表達下調更顯著(P0.05)。5.隨著PM2.5濃度的增加,H1299、H292細胞中p-mTOR和p-P70S6K1的表達下調(P0.05)。體內暴露Wistar大鼠,延長暴露時間(2、4周),p-mTOR和p-P70S6K1的表達顯著下調(P0.05)。結論1.PM2.5暴露改變了呼吸道局部的菌群豐度及多樣性,打破了呼吸道菌群平衡。2.PM2.5處理后使大鼠肺組織生物合成發(fā)生障礙,誘導人H292、H1299細胞周期阻滯;mTOR/P70S6K1信號通路在其介導的生物學效應中起關鍵作用,且推測TS是PM2.5暴露后調節(jié)細胞周期過程的靶點。
【學位授予單位】：沈陽醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R994.6;X513
【圖文】：

圖１染塵前后組間比較的Ｖｅｎｎ圖逡逑注：Ａ邋組：Ｃｏｎｔｒｏｌ，邋Ｂ邋組：２Ｗ，邋Ｃ邋組：４Ｗ？逡逑

染塵前后菌群門水平物種豐度圖

圖４邋ＰＭ２．５暴露后誘導人肺上皮細胞周期阻滯和下調ｃｙｃｌｉｎＤ丨蛋白的表達逡逑（Ａ）流式細胞術分析Ｈ１２９９和Ｈ２９２細胞的周期。Ｗｅｓｔｅｒｎ檢測（Ｂ）邋Ｈ１２９９和Ｈ２９２細胞逡逑和（Ｃ）大鼠肺組織中ｃｙｃｌｉｎＤｌ蛋白的表達水平。最終結果總結在條形圖中，數(shù)據(jù)表示為平逡逑均值士標準差（＊尸＜０．０５）。逡逑

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本文編號：2746687