【摘要】：目的近些年,伴隨著快速的工業(yè)發(fā)展,大氣污染問題愈加嚴(yán)重,頻繁出現(xiàn)了霧霾天氣。空氣細(xì)顆粒物的濃度與霧霾天氣的出現(xiàn)有著緊密聯(lián)系,因而對空氣中PM2.5(Particulate Matter 2.5)等細(xì)顆粒物的研究成為熱點(diǎn)。本課題采集大氣中的以PM2.5直徑為主的細(xì)顆粒物,制備PM2.5氣霧化暴露Wistar大鼠模型及PM2.5混懸液處理人肺上皮細(xì)胞H1299、H292細(xì)胞模型,研究PM2.5對大鼠上呼吸道菌群組成改變及人肺上皮細(xì)胞因PM2.5引起周期阻滯的影響。通過使用單濃度口鼻暴露系統(tǒng)(HRH-MNE3026)進(jìn)行染塵,高通量測序檢測Wistar大鼠染塵前后上呼吸道菌群差異,Western檢測肺組織、H1299、H292細(xì)胞的cyclinD1、TS、mTOR、P70S6K1表達(dá)水平。通過相應(yīng)指標(biāo)探討大氣污染物PM2.5影響上呼吸道菌群組成及誘導(dǎo)人肺上皮細(xì)胞周期阻滯的情況。方法1.收集PM2.5的纖維濾紙,按國家環(huán)境質(zhì)量二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的10倍,制備一定濃度(750 μg/m3)的PM2.5混懸液暴露Wistar大鼠模型。2.應(yīng)用16S rDNA檢測染塵前后不同時(shí)間段(2W、4W)大鼠口咽部菌群的變化情況。3.流式細(xì)胞儀檢測PM2.5處理前后兩種傳代細(xì)胞系(人肺上皮H292和H1299細(xì)胞)細(xì)胞周期的改變。4.Western檢測兩個(gè)細(xì)胞系及暴露2周、4周后大鼠肺組織中TS、cyclinD1、mTOR、P70S6K1蛋白的表達(dá)量。5.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染:用TS的siRNA抑制劑轉(zhuǎn)染H292細(xì)胞,抑制TS分子的表達(dá)。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:第一部分16S rDNA高通量測序結(jié)果,使用R Studio軟件完成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析,呼吸道菌群的異同性采用聚類分析;P值計(jì)算基于Wilcoxon秩和檢驗(yàn),并經(jīng)過FDR校正(P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第二部分結(jié)果采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析,用方差分析確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P0.05),認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.16S rDNA高通量測序結(jié)果顯示,隨著大鼠染塵時(shí)間的增加,呼吸道菌群組間豐度及多樣性有所改變,使得呼吸道菌群中優(yōu)勢菌減少,條件致病菌菌群豐度增加。2.PM2.5處理H292、H1299細(xì)胞48 h后,H292、H1299細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在S期,cyclinD1的表達(dá)下調(diào)(P0.05)。當(dāng)PM2.5濃度為200 μg/mL時(shí),S期細(xì)胞百分比分別達(dá)到50.35%和56.20%。為了分析PM2.5誘導(dǎo)的肺損傷,采用暴露染塵Wistar大鼠實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞暴露實(shí)驗(yàn)一致,PM2.5暴露組中cyclinD1蛋白表達(dá)下調(diào)(P0.05)。3.隨著PM2.5處理H292和H1299細(xì)胞濃度的增加,TS蛋白表達(dá)下調(diào)(P0.05)。體內(nèi)暴露Wistar大鼠后,暴露組肺組織TS蛋白表達(dá)也下調(diào)(P0.05)。4.H292細(xì)胞中抑制TS分子的表達(dá),導(dǎo)致PM2.5暴露后細(xì)胞周期阻滯更明顯和cyclin D1蛋白表達(dá)下調(diào)更顯著(P0.05)。5.隨著PM2.5濃度的增加,H1299、H292細(xì)胞中p-mTOR和p-P70S6K1的表達(dá)下調(diào)(P0.05)。體內(nèi)暴露Wistar大鼠,延長暴露時(shí)間(2、4周),p-mTOR和p-P70S6K1的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)。結(jié)論1.PM2.5暴露改變了呼吸道局部的菌群豐度及多樣性,打破了呼吸道菌群平衡。2.PM2.5處理后使大鼠肺組織生物合成發(fā)生障礙,誘導(dǎo)人H292、H1299細(xì)胞周期阻滯;mTOR/P70S6K1信號(hào)通路在其介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)中起關(guān)鍵作用,且推測TS是PM2.5暴露后調(diào)節(jié)細(xì)胞周期過程的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：沈陽醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R994.6;X513
【圖文】：

圖１染塵前后組間比較的Ｖｅｎｎ圖逡逑注：Ａ邋組：Ｃｏｎｔｒｏｌ，邋Ｂ邋組：２Ｗ，邋Ｃ邋組：４Ｗ？逡逑

染塵前后菌群門水平物種豐度圖

圖４邋ＰＭ２．５暴露后誘導(dǎo)人肺上皮細(xì)胞周期阻滯和下調(diào)ｃｙｃｌｉｎＤ丨蛋白的表達(dá)逡逑（Ａ）流式細(xì)胞術(shù)分析Ｈ１２９９和Ｈ２９２細(xì)胞的周期。Ｗｅｓｔｅｒｎ檢測（Ｂ）邋Ｈ１２９９和Ｈ２９２細(xì)胞逡逑和（Ｃ）大鼠肺組織中ｃｙｃｌｉｎＤｌ蛋白的表達(dá)水平。最終結(jié)果總結(jié)在條形圖中，數(shù)據(jù)表示為平逡逑均值士標(biāo)準(zhǔn)差（＊尸＜０．０５）。逡逑

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本文編號(hào)：2746687