發(fā)布時(shí)間：2020-07-07 17:48

【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一種嗜肝DNA病毒,可通過(guò)血液、母嬰、性接觸和皮膚黏膜破損等途徑傳播,長(zhǎng)期感染可引發(fā)慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)、肝代謝失常、肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的相關(guān)統(tǒng)計(jì),全球大概有2.6億慢性乙肝患者,主要分布在亞洲和非洲等地區(qū),我國(guó)是乙肝高發(fā)國(guó),慢性乙肝患者約兩千萬(wàn)人。乙肝發(fā)病率高,病程長(zhǎng),目前已上市的核苷(酸)類抗HBV小分子藥物無(wú)法治愈乙肝。因此,研發(fā)安全高效的非核苷類HBV抑制劑具有重要意義。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展,HBV生命周期中多個(gè)靶點(diǎn)近年來(lái)被相繼報(bào)道。其中,HBV核衣殼蛋白在整個(gè)生命周期中起著重要作用,包括參與前基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄,自由環(huán)狀DNA的合成和亞病毒顆粒的形成。核衣殼蛋白抑制劑可以通過(guò)干擾核衣殼的正常裝配、誘導(dǎo)形成不規(guī)則的多聚物、促進(jìn)核心蛋白的降解或促進(jìn)不含病毒基因的“空殼”的形成等機(jī)制來(lái)抑制HBV的復(fù)制。該類抑制劑對(duì)于野生株和突變株均有較好的抑制活性,并能與核苷類藥物發(fā)揮協(xié)同抗病毒作用,是目前研究最多的非核苷類小分子抑制劑。二氫嘧啶(Heteroaryldihydropyrimidin,HAP)類HBV核衣殼蛋白抑制劑GLS4具有較好的抗病毒活性,其抑制HBV DNA復(fù)制活性已達(dá)到納摩爾級(jí)別(HepG2.2.15細(xì)胞系,IC50= 12 nM),對(duì)阿德福韋耐藥株也有較好的活性(rtA181V,IC50= 0.161 μM;rtN236T,IC50= 0.131 μM),目前正由廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司進(jìn)行Ⅱ期臨床研究。但是,GLS4的水溶性較差,口服生物利用度不高(cLogP=4.7,F=14%),限制了其臨床應(yīng)用。針對(duì)以上問(wèn)題,本論文第二章采用前藥修飾策略,將優(yōu)勢(shì)基團(tuán)“5-甲基-2-氧代-1,3-二氧雜環(huán)戊烯”引入到二氫嘧啶母環(huán)1位氮原子上,設(shè)計(jì)合成了 GLS4的前藥 Ⅰ-5,并對(duì)其進(jìn)行了體外細(xì)胞活性(細(xì)胞毒性、抑制HBV DNA復(fù)制活性和抑制抗原分泌活性)、水溶性、急性毒性和藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Ⅰ-5的細(xì)胞毒性較低(CC5050μM),抑制HBV DNA復(fù)制活性較高(IC50為0.041 ±0.045 μM),與GLS4相當(dāng)(IC50=0.035±0.025 μM),是上市藥物拉米夫定的40多倍(IC50= 1.73±0.28μM);另外,Ⅰ-5表現(xiàn)了一定的抑制HBsAg和HBeAg抗原分泌的活性,其IC50分別為17.87±0.8 μM和0.39±0.1 μM,與先導(dǎo)化合物GLS4 水平相當(dāng)(IC50分別為 15.82±0.4μM和0.18±0.03 μM),且遠(yuǎn)高于拉米夫定 IC5050μM)。除此之外,Ⅰ-5在pH為7.4的PBS緩沖液中的溶解度(15.13 μg/mL)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于相同條件下GLS4的溶解度(0.32 μg/mL);按最大劑量2 g/kg對(duì)小鼠灌胃時(shí),Ⅰ-5表現(xiàn)出較低的急性毒性;但是1-5在體內(nèi)極不穩(wěn)定,代謝成其他產(chǎn)物,藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)較差,無(wú)法釋放足夠濃度的活性原藥。本論文第三章根據(jù)課題組前期對(duì)二氫嘧啶類HBV核衣殼蛋白抑制劑構(gòu)效關(guān)系的探討,基于核衣殼蛋白晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究,靶向蛋白溶劑界面運(yùn)用基于晶體結(jié)構(gòu)的分子雜合策略及生物電子等排原理進(jìn)行二氫嘧啶類抑制劑的結(jié)構(gòu)修飾,共設(shè)計(jì)合成了兩類結(jié)構(gòu)新穎的二氫嘧啶-磺酰胺和二氫嘧啶-磷酰胺衍生物,并進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性、抑制HBV DNA復(fù)制活性和抑制抗原分泌活性測(cè)試及分子模擬研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:磺酰胺系列的R1基團(tuán)中,硝基的取代有利于提高活性,但取代基的位置對(duì)活性影響很大,鄰位和對(duì)位活性較好,間位取代導(dǎo)致活性的喪失;磷酰胺的R2基團(tuán)中,芐基的取代活性最好,引入氟原子有助于進(jìn)一步提高活性,但較大的取代基導(dǎo)致毒性變大。其中,化合物Ⅱ-6m的細(xì)胞毒性較小(CC5050 μM),抑制HBV DNA復(fù)制的活性(IC50=0.76±0.12 μM)達(dá)到了上市藥物拉米夫定(IC50=0.62±0.31 μM)的水平,還表現(xiàn)出一定的抑制e抗原分泌活性(IC50=18.12±7.9 μM)。分子模擬結(jié)果顯示Ⅱ-6m的磺酰胺基團(tuán)與核心蛋白的Leu140主鏈形成氫鍵作用力,驗(yàn)證了設(shè)計(jì)思路。Ⅱ-6m可作為先導(dǎo)化合物供進(jìn)一步修飾。綜上,本論文根據(jù)二氫嘧啶類抗乙肝臨床藥物GLS4的結(jié)構(gòu)特征、已知構(gòu)效關(guān)系和核衣殼蛋白晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu),分別運(yùn)用前藥、基于晶體結(jié)構(gòu)的分子雜合和生物電子等排原理的設(shè)計(jì)策略,并經(jīng)體外抗HBV活性篩選發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)新穎的“5-甲基-2-氧代-1,3-二氧雜環(huán)戊烯”類GLS4前藥、二氫嘧啶-磺酰胺和二氫嘧啶-磷酰胺衍生物共三類活性分子,具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的前景;探討了目標(biāo)化合物的構(gòu)效關(guān)系和代表性化合物的結(jié)合模式,為該類藥物的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R914;R96
【圖文】：

第一節(jié)乙肝病毒及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)逡逑ＨＢＶ是一種嗜肝性（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）的ＤＮＡ病毒，包括大球形顆粒、小逡逑球形顆粒和管形顆粒三種形態(tài)（圖１－１），其中，大球形顆粒又稱Ｄａｎｅ顆粒，逡逑直徑大約為４２邋ｎｍ，攜帶ＨＢＶ遺傳物質(zhì)，具有感染性｜５］。完整的大球形顆粒外逡逑層是磷脂雙分子層，脂膜上鑲嵌著大、中、小三種包膜蛋白，即乙肝病毒表面抗逡逑原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ邋Ｂ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＢｓＡｇ）；內(nèi)層是一個(gè)正二十面體的核殼體，由逡逑核心抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ邋Ｂ邋ｃｏｒｅ邋ａｎｔｉｇｅｎ，邋ＨＢｃＡｇ）聚集形成，ＨＢｃＡｇ邋含有邋１８３－１８５邋個(gè)逡逑氨基酸殘基，分為衣殼裝配域和核酸結(jié)合域［Ｍ］。核心蛋Ａ通常以二聚體的形式逡逑存在，單體之間通過(guò)６］位的半胱氨酸殘基（Ｃｙｓ－６１）以二硫鍵保持穩(wěn)定性；三逡逑個(gè)二聚體再通過(guò)疏水作用力結(jié)合變成六聚體，六聚體進(jìn)一步組裝得到完整且穩(wěn)定逡逑的核衣殼。９０或１２０個(gè)二聚體組裝成兩種核心蛋白顆粒（Ｔ邋＝邋３或４）邋

圖１－２邋ＨＢＶ基因組結(jié)構(gòu)［１４］逡逑第二節(jié)乙肝病毒的生命周期逡逑如圖１－３所示，ＨＢＶ完整的生命周期包括：侵入、脫殼、遺傳物質(zhì)的－放、逡逑ｃｃｃＤＮＡ的合成、轉(zhuǎn)錄、翻譯、核殼體的包裝、逆轉(zhuǎn)錄、ＤＮＡ復(fù)制、表面蛋白逡逑包裹修飾、分泌出胞等步驟［１４—１７］。逡逑ＨＢＶ感染宿主后，經(jīng)血液循環(huán)濃集于肝臟附近，病毒顆粒與肝細(xì)胞表面的逡逑硫酸乙酰肝素蛋白聚糖受體（ｈｅｐａｒａｎ邋ｓｕｌｆａｔｅ邋ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ，邋ＨＳＰＧ）特異性結(jié)合逡逑［１８］，接著病毒表面蛋白的ＰｒｅＳｌ區(qū)與牛橫膽酸鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（ｓｏｄｉｕｍ逡逑ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ邋ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ邋ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＮＴＣＰ）相互作用［１９］，病毒顆粒隨之被攝逡逑取進(jìn)入胞內(nèi)。此時(shí)核殼體裂解，釋放ｒｃＤＮＡ，ｒｃＤＮＡ穿過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核［２°］。逡逑在宿主聚合酶的作用下，以負(fù)鏈為模板修補(bǔ)正鏈得到共價(jià)閉合環(huán)狀ＤＮＡ逡逑（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ邋ｃｌｏｓｅｄ邋ｃｉｒｃｕｌａｒ邋ＤＮＡ，ｃｃｃＤＮＡ）邋［２１］。以邋ｃｃｃＤＮＡ邋為模板，病毒利用逡逑宿主細(xì)胞的ＲＮＡ聚合酶轉(zhuǎn)錄合成四種長(zhǎng)度的ＲＮＡ邋（３．５邋ｋｂ、２．４邋ｋｂ、２．１邋ｋｂ和０．７逡逑ｋｂ）

逡逑圖１－２邋ＨＢＶ基因組結(jié)構(gòu)［１４］逡逑第二節(jié)乙肝病毒的生命周期逡逑如圖１－３所示，ＨＢＶ完整的生命周期包括：侵入、脫殼、遺傳物質(zhì)的－放、逡逑ｃｃｃＤＮＡ的合成、轉(zhuǎn)錄、翻譯、核殼體的包裝、逆轉(zhuǎn)錄、ＤＮＡ復(fù)制、表面蛋白逡逑包裹修飾、分泌出胞等步驟［１４—１７］。逡逑ＨＢＶ感染宿主后，經(jīng)血液循環(huán)濃集于肝臟附近，病毒顆粒與肝細(xì)胞表面的逡逑硫酸乙酰肝素蛋白聚糖受體（ｈｅｐａｒａｎ邋ｓｕｌｆａｔｅ邋ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ，邋ＨＳＰＧ）特異性結(jié)合逡逑［１８］，接著病毒表面蛋白的ＰｒｅＳｌ區(qū)與牛橫膽酸鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（ｓｏｄｉｕｍ逡逑ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ邋ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ邋ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＮＴＣＰ）相互作用［１９］，病毒顆粒隨之被攝逡逑取進(jìn)入胞內(nèi)。此時(shí)核殼體裂解，釋放ｒｃＤＮＡ，ｒｃＤＮＡ穿過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核［２°］。逡逑在宿主聚合酶的作用下，以負(fù)鏈為模板修補(bǔ)正鏈得到共價(jià)閉合環(huán)狀ＤＮＡ逡逑（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ邋ｃｌｏｓｅｄ邋ｃｉｒｃｕｌａｒ邋ＤＮＡ

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本文編號(hào)：2745414