【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一種嗜肝DNA病毒,可通過血液、母嬰、性接觸和皮膚黏膜破損等途徑傳播,長期感染可引發(fā)慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)、肝代謝失常、肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的相關統(tǒng)計,全球大概有2.6億慢性乙肝患者,主要分布在亞洲和非洲等地區(qū),我國是乙肝高發(fā)國,慢性乙肝患者約兩千萬人。乙肝發(fā)病率高,病程長,目前已上市的核苷(酸)類抗HBV小分子藥物無法治愈乙肝。因此,研發(fā)安全高效的非核苷類HBV抑制劑具有重要意義。隨著結構生物學的發(fā)展,HBV生命周期中多個靶點近年來被相繼報道。其中,HBV核衣殼蛋白在整個生命周期中起著重要作用,包括參與前基因組RNA的逆轉錄,自由環(huán)狀DNA的合成和亞病毒顆粒的形成。核衣殼蛋白抑制劑可以通過干擾核衣殼的正常裝配、誘導形成不規(guī)則的多聚物、促進核心蛋白的降解或促進不含病毒基因的“空殼”的形成等機制來抑制HBV的復制。該類抑制劑對于野生株和突變株均有較好的抑制活性,并能與核苷類藥物發(fā)揮協(xié)同抗病毒作用,是目前研究最多的非核苷類小分子抑制劑。二氫嘧啶(Heteroaryldihydropyrimidin,HAP)類HBV核衣殼蛋白抑制劑GLS4具有較好的抗病毒活性,其抑制HBV DNA復制活性已達到納摩爾級別(HepG2.2.15細胞系,IC50= 12 nM),對阿德福韋耐藥株也有較好的活性(rtA181V,IC50= 0.161 μM;rtN236T,IC50= 0.131 μM),目前正由廣東東陽光藥業(yè)有限公司進行Ⅱ期臨床研究。但是,GLS4的水溶性較差,口服生物利用度不高(cLogP=4.7,F=14%),限制了其臨床應用。針對以上問題,本論文第二章采用前藥修飾策略,將優(yōu)勢基團“5-甲基-2-氧代-1,3-二氧雜環(huán)戊烯”引入到二氫嘧啶母環(huán)1位氮原子上,設計合成了 GLS4的前藥 Ⅰ-5,并對其進行了體外細胞活性(細胞毒性、抑制HBV DNA復制活性和抑制抗原分泌活性)、水溶性、急性毒性和藥代動力學測定。實驗結果表明:Ⅰ-5的細胞毒性較低(CC5050μM),抑制HBV DNA復制活性較高(IC50為0.041 ±0.045 μM),與GLS4相當(IC50=0.035±0.025 μM),是上市藥物拉米夫定的40多倍(IC50= 1.73±0.28μM);另外,Ⅰ-5表現(xiàn)了一定的抑制HBsAg和HBeAg抗原分泌的活性,其IC50分別為17.87±0.8 μM和0.39±0.1 μM,與先導化合物GLS4 水平相當(IC50分別為 15.82±0.4μM和0.18±0.03 μM),且遠高于拉米夫定 IC5050μM)。除此之外,Ⅰ-5在pH為7.4的PBS緩沖液中的溶解度(15.13 μg/mL)遠遠高于相同條件下GLS4的溶解度(0.32 μg/mL);按最大劑量2 g/kg對小鼠灌胃時,Ⅰ-5表現(xiàn)出較低的急性毒性;但是1-5在體內極不穩(wěn)定,代謝成其他產物,藥代動力學性質較差,無法釋放足夠濃度的活性原藥。本論文第三章根據(jù)課題組前期對二氫嘧啶類HBV核衣殼蛋白抑制劑構效關系的探討,基于核衣殼蛋白晶體復合物結構生物學研究,靶向蛋白溶劑界面運用基于晶體結構的分子雜合策略及生物電子等排原理進行二氫嘧啶類抑制劑的結構修飾,共設計合成了兩類結構新穎的二氫嘧啶-磺酰胺和二氫嘧啶-磷酰胺衍生物,并進行了體外細胞毒性、抑制HBV DNA復制活性和抑制抗原分泌活性測試及分子模擬研究。實驗結果表明:磺酰胺系列的R1基團中,硝基的取代有利于提高活性,但取代基的位置對活性影響很大,鄰位和對位活性較好,間位取代導致活性的喪失;磷酰胺的R2基團中,芐基的取代活性最好,引入氟原子有助于進一步提高活性,但較大的取代基導致毒性變大。其中,化合物Ⅱ-6m的細胞毒性較小(CC5050 μM),抑制HBV DNA復制的活性(IC50=0.76±0.12 μM)達到了上市藥物拉米夫定(IC50=0.62±0.31 μM)的水平,還表現(xiàn)出一定的抑制e抗原分泌活性(IC50=18.12±7.9 μM)。分子模擬結果顯示Ⅱ-6m的磺酰胺基團與核心蛋白的Leu140主鏈形成氫鍵作用力,驗證了設計思路。Ⅱ-6m可作為先導化合物供進一步修飾。綜上,本論文根據(jù)二氫嘧啶類抗乙肝臨床藥物GLS4的結構特征、已知構效關系和核衣殼蛋白晶體復合物結構,分別運用前藥、基于晶體結構的分子雜合和生物電子等排原理的設計策略,并經體外抗HBV活性篩選發(fā)現(xiàn)了結構新穎的“5-甲基-2-氧代-1,3-二氧雜環(huán)戊烯”類GLS4前藥、二氫嘧啶-磺酰胺和二氫嘧啶-磷酰胺衍生物共三類活性分子,具有進一步開發(fā)的前景;探討了目標化合物的構效關系和代表性化合物的結合模式,為該類藥物的深入研究奠定了基礎。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914;R96
【圖文】：

第一節(jié)乙肝病毒及其結構特點逡逑ＨＢＶ是一種嗜肝性（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）的ＤＮＡ病毒，包括大球形顆粒、小逡逑球形顆粒和管形顆粒三種形態(tài)（圖１－１），其中，大球形顆粒又稱Ｄａｎｅ顆粒，逡逑直徑大約為４２邋ｎｍ，攜帶ＨＢＶ遺傳物質，具有感染性｜５］。完整的大球形顆粒外逡逑層是磷脂雙分子層，脂膜上鑲嵌著大、中、小三種包膜蛋白，即乙肝病毒表面抗逡逑原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ邋Ｂ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＢｓＡｇ）；內層是一個正二十面體的核殼體，由逡逑核心抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ邋Ｂ邋ｃｏｒｅ邋ａｎｔｉｇｅｎ，邋ＨＢｃＡｇ）聚集形成，ＨＢｃＡｇ邋含有邋１８３－１８５邋個逡逑氨基酸殘基，分為衣殼裝配域和核酸結合域［Ｍ］。核心蛋Ａ通常以二聚體的形式逡逑存在，單體之間通過６］位的半胱氨酸殘基（Ｃｙｓ－６１）以二硫鍵保持穩(wěn)定性；三逡逑個二聚體再通過疏水作用力結合變成六聚體，六聚體進一步組裝得到完整且穩(wěn)定逡逑的核衣殼。９０或１２０個二聚體組裝成兩種核心蛋白顆粒（Ｔ邋＝邋３或４）邋

圖１－２邋ＨＢＶ基因組結構［１４］逡逑第二節(jié)乙肝病毒的生命周期逡逑如圖１－３所示，ＨＢＶ完整的生命周期包括：侵入、脫殼、遺傳物質的－放、逡逑ｃｃｃＤＮＡ的合成、轉錄、翻譯、核殼體的包裝、逆轉錄、ＤＮＡ復制、表面蛋白逡逑包裹修飾、分泌出胞等步驟［１４—１７］。逡逑ＨＢＶ感染宿主后，經血液循環(huán)濃集于肝臟附近，病毒顆粒與肝細胞表面的逡逑硫酸乙酰肝素蛋白聚糖受體（ｈｅｐａｒａｎ邋ｓｕｌｆａｔｅ邋ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ，邋ＨＳＰＧ）特異性結合逡逑［１８］，接著病毒表面蛋白的ＰｒｅＳｌ區(qū)與牛橫膽酸鈉協(xié)同轉運多肽（ｓｏｄｉｕｍ逡逑ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ邋ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ邋ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＮＴＣＰ）相互作用［１９］，病毒顆粒隨之被攝逡逑取進入胞內。此時核殼體裂解，釋放ｒｃＤＮＡ，ｒｃＤＮＡ穿過核孔進入細胞核［２°］。逡逑在宿主聚合酶的作用下，以負鏈為模板修補正鏈得到共價閉合環(huán)狀ＤＮＡ逡逑（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ邋ｃｌｏｓｅｄ邋ｃｉｒｃｕｌａｒ邋ＤＮＡ，ｃｃｃＤＮＡ）邋［２１］。以邋ｃｃｃＤＮＡ邋為模板，病毒利用逡逑宿主細胞的ＲＮＡ聚合酶轉錄合成四種長度的ＲＮＡ邋（３．５邋ｋｂ、２．４邋ｋｂ、２．１邋ｋｂ和０．７逡逑ｋｂ）

逡逑圖１－２邋ＨＢＶ基因組結構［１４］逡逑第二節(jié)乙肝病毒的生命周期逡逑如圖１－３所示，ＨＢＶ完整的生命周期包括：侵入、脫殼、遺傳物質的－放、逡逑ｃｃｃＤＮＡ的合成、轉錄、翻譯、核殼體的包裝、逆轉錄、ＤＮＡ復制、表面蛋白逡逑包裹修飾、分泌出胞等步驟［１４—１７］。逡逑ＨＢＶ感染宿主后，經血液循環(huán)濃集于肝臟附近，病毒顆粒與肝細胞表面的逡逑硫酸乙酰肝素蛋白聚糖受體（ｈｅｐａｒａｎ邋ｓｕｌｆａｔｅ邋ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ，邋ＨＳＰＧ）特異性結合逡逑［１８］，接著病毒表面蛋白的ＰｒｅＳｌ區(qū)與牛橫膽酸鈉協(xié)同轉運多肽（ｓｏｄｉｕｍ逡逑ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ邋ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ邋ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＮＴＣＰ）相互作用［１９］，病毒顆粒隨之被攝逡逑取進入胞內。此時核殼體裂解，釋放ｒｃＤＮＡ，ｒｃＤＮＡ穿過核孔進入細胞核［２°］。逡逑在宿主聚合酶的作用下，以負鏈為模板修補正鏈得到共價閉合環(huán)狀ＤＮＡ逡逑（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ邋ｃｌｏｓｅｄ邋ｃｉｒｃｕｌａｒ邋ＤＮＡ

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