【摘要】：海洋微生物能產(chǎn)生多種異于陸生微生物的重要活性化合物。眾所周知,二十碳五烯酸(EPA)和鼠李糖脂是益于人類健康的活性物質(zhì)。然而生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低等問題的存在限制了它們的大規(guī)模開發(fā)和應(yīng)用,因此如何提高活性物質(zhì)的產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本一直是研究人員關(guān)注的問題。而這些活性物質(zhì)的合成和調(diào)控復(fù)雜增加了解決問題的難度。為此,本文以產(chǎn)EPA的微擬球藻PJ12和產(chǎn)鼠李糖脂的假單胞菌ZS1為研究對象,深入了解目的產(chǎn)物的合成及相關(guān)基因調(diào)控。本文從高通量基因表達(dá)(GEO)數(shù)據(jù)庫中獲取微擬球藻PJ12分別培養(yǎng)在缺氮條件和不缺氮條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),對其組裝和注釋,共得到20,096條被注釋的ESTs,4,651條ESTs差異表達(dá)。基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)重建了與EPA生物合成相關(guān)的代謝通路,發(fā)現(xiàn)在氮脅迫條件下卡爾文循環(huán)、糖酵解以及脂肪酸合成途徑中幾乎所有酶的活性均下降,而三羧酸循環(huán)和β-氧化中大部分酶活性顯著升高。值得注意的是,在氮脅迫條件下EPA生物合成途徑中Δ6去飽和酶和Δ15去飽和酶的活性顯著下降。本文還從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取假單胞菌ZS1分別在礦物鹽培養(yǎng)基中添加了 2%葡萄糖和2%酵母提取物的條件下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),基于基因組信息進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,重建了與鼠李糖脂合成相關(guān)的代謝通路,發(fā)現(xiàn)在葡萄糖條件下參與Entner-Doudoroff途徑和鼠李糖脂及其前體合成過程的大部分基因顯著上調(diào)表達(dá),而參與三羧酸循環(huán)的大部分基因均下調(diào)表達(dá)�；诩賳伟鶽S1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),本文提出SPAdes結(jié)合RAST平臺對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝和注釋的新方法,發(fā)現(xiàn)該方法獲得基因與基于基因組獲得的基因長度間相關(guān)性系數(shù)r2高達(dá)0.979,而且發(fā)現(xiàn)分析代謝途徑結(jié)果與基于基因組的近乎相同。綜上所述,本文通過對微擬球藻PJ12和假單胞菌ZS1的轉(zhuǎn)錄組分析,不僅增加了對EPA和鼠李糖脂生物合成相關(guān)代謝通路的了解,而且發(fā)現(xiàn)了影響其生物合成的重要基因,為后續(xù)通過代謝工程手段提高EPA和鼠李糖脂產(chǎn)量提供理論依據(jù)和參考。同時原核生物轉(zhuǎn)錄組新分析方法的提出為轉(zhuǎn)錄組研究提供一種新的分析思路。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R915
【圖文】：

網(wǎng)上通過脂肪酸延長酶和去飽和酶催化，經(jīng)過一系列反應(yīng)而獲得的［３２］。其中脂肪逡逑酸去飽和酶是多不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，它們控制著多不飽和脂肪酸去飽和逡逑的程度［３３］。圖１．２為微擬球藻中ＥＰＡ的生物合成途徑。逡逑ＥＰＡ的合成過程中需要一系列酶進(jìn)行催化，經(jīng)過縮合、還原、脫水等反應(yīng)來逡逑４逡逑

集的ＥＳＴｓ越多。方框標(biāo)出的為該通路中ＥＳＴ富集的窗，而星號（＊）表示差異表達(dá)ＥＳＴｓ逡逑富集的通路。逡逑圖２．３Ａ是藻株ＰＪ１２培養(yǎng)在ＮＲ條件下１２，６０９條ＥＳＴｓ代謝通路富集的分析逡逑結(jié)果。從圖可見，有９條代謝通路富集差異表徸的ＥＳＴｓ，分別為Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ／逡逑ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ、ＴＣＡ邋ｃｙｃｌｅ、Ｐｅｎｔｏｓｅ邋ｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｐａｔｈｗａｙ、Ａｍｉｎｏ邋ｓｕｇａｒ邋ａｎｄ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ逡逑ｓｕｇａｒ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｐｙｒｕｖａｔｅ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ邋ａｎｄ邋ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、逡逑Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ、Ｃａｒｂｏｎ邋ｆｉｘａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｏｒｇａｎｉｓｍｓ邋禾口邋Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ逡逑ａｎｄ邋ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ。其中邋４邋條邋Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ邋和邋２邋條邋Ｅｎｅｒｇｙ逡逑ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ通路的１號窗中富集較多的ＥＳＴｓ，這些ＥＳＴｓ表徸水平較高，為維持逡逑藻細(xì)胞的正常生命活動提供物質(zhì)基礎(chǔ)和能量來源。逡逑圖２．３Ｂ是藻株ＰＪ１２培養(yǎng)在ＮＤ條件下１２

素等含量會下降，而糖類、脂類等不需要氮元素參與合成的營養(yǎng)組成含量會明顯逡逑上升＿。逡逑圖２．３Ｃ是４，６５１個差異表徶ＥＳＴｓ代謝通路富集的結(jié)果。從圖可知，有３條逡逑代謝通路富集差異表達(dá)的ＥＳＴｓ，分別是ＴＣＡ邋ｃｙｃｌｅ、Ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ和逡逑Ｇｌｙｃｅｒｏｌｉｐｉｄ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ。其中富集于邋Ｇｌｙｃｅｒｏｌｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ邋的邋ＥＳＴｓ邋主要在邋１邋和逡逑２窗，說明這些ＥＳＴｓ在ＮＤ條件下被誘導(dǎo)高表達(dá)，有助于甘油脂類的積累。逡逑２．２．７基于ＥＰＡ生物合成的相關(guān)通路分析結(jié)果逡逑根據(jù)獲得注釋的穩(wěn)定表達(dá)的１２，６０９條ＥＴＳｓ代謝通路注釋結(jié)果，將相關(guān)的通逡逑路如邋Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ／ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｃａｌｖｉｎ邋ｃｙｃｌｅ、ＴＣＡ邋ｃｙｃｌｅ、Ｐ－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ、Ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄ逡逑ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ和ＥＰＡ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ途徑進(jìn)行重建。通過比較ＮＤ和ＮＲ兩種條件下相逡逑關(guān)ＥＳＴｓ表達(dá)上下調(diào)變化情況，來了解相關(guān)代謝流的方向，特別是與ＥＰＡ生物合逡逑成相關(guān)的基因調(diào)控表達(dá)。逡逑Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ逡逑１２．７．１．１邋ＴｔＸ２￣］邐Ｃａｌｖｉｎ邋ｃｙｃｌｅ逡逑Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ－６Ｐ邐Ｅｒ＞ｔｈｒｏｓｅ－４Ｐ邋—｜４Ｔｌ．２．１３｜—＞？邋Ｓｅｄｏｈｅｐｔｕｌｏｓｅ－ｌ

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本文編號：2745077